孕激素对人子宫内膜癌细胞体外增殖、凋亡的影响

尤俊岭

（辽宁省锦州市妇婴医院妇产科，辽宁 锦州 121001）

孕激素对人子宫内膜癌细胞体外增殖、凋亡的影响

尤俊岭

（辽宁省锦州市妇婴医院妇产科，辽宁 锦州 121001）

目的探讨孕激素对人子宫内膜癌细胞对体外增殖及凋亡的影响。方法体外培养子宫内膜癌细胞，采用流式细胞仪观察不同浓度孕酮对细胞周期及凋亡率的影响、光学显微镜检测其形态学变化、MTT比色法观察不同浓度孕酮对细胞增殖的作用。结果流式细胞仪分析，实验组G0/G1期上升，S期下降，细胞凋亡率上升；光镜可观察到细胞凋亡的形态学改变；MTT结果显示，随着孕酮浓度的增加，其对细胞生长的抑制作用明显增强，与对照组比较，差异有显著性，且具有剂量依赖性。结论孕酮抑制子宫内膜癌细胞的增殖，并诱导其凋亡。

子宫内膜癌；孕酮；增殖；凋亡

近年来，子宫内膜癌的孕激素治疗已经受到越来越多的关注和研究，临床应用也取得了较大进展。本研究采用MTT、FCM及形态学检测手段观察了不同浓度的孕激素在体外对子宫内膜癌细胞增殖及凋亡的影响，从而为临床治疗内膜癌可否进行激素替代治疗提供了理论依据，进而证实孕激素治疗子宫内膜癌的疗效性和进一步探索的远大前景。

1 材料与方法

1.1 材料：孕酮、DMEM培养基购自美国Sigma公司，胎牛血清、胰蛋白酶、MTT（四甲基偶氮唑盐）购自北京华美生物技术有限公司，Annexin-V-FITC凋亡检测试剂盒购自北京宝赛生物技术有限公司。子宫内膜癌细胞株HEC-1B细胞由北京大学医学部细胞生物中心研究室惠赠。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及分组：将子宫内膜癌细胞株HEC-1B细胞于37 ℃、5%二氧化碳的饱和湿度条件下，在含10%的胎牛血清的DMEM培养基内培养。共分5组，对照组：不加孕激素；治疗组根据所加浓度的不同分为：10-5mol/L组、10-6mol/L组、10-7mol/L组及10-8mol/L组。

1.2.2 细胞周期与凋亡率的检测：将细胞浓度为1×105个/mL的子宫内膜癌单细胞悬液接种于24孔培养板中（每孔1 mL），每孔加入1 mL的DMEM培养液，于37 ℃、5%二氧化碳的饱和湿度培养箱内培养，过夜贴壁后，4 ℃培养1 h，以促进细胞同步化生长；换培养液，实验组分别加入含孕酮10-8、10-7、10-6、10-5mol/L的培养液，对照组加等体积的纯培养液。继续培养72 h后，胰蛋白酶消化，收集细胞，应用Annexin-V-FITC凋亡检测试剂盒（参照说明书的步骤），置流式细胞仪（FCM）分析。

1.2.3 细胞凋亡形态学观察：24孔培养板底内放置消毒过的玻璃盖片，每孔加入1 mL的浓度为1×105/mL的子宫内膜癌单细胞悬液，于37 ℃、5%二氧化碳的饱和湿度培养箱内培养，实验组和对照组处理同1、2、2，继续培养48 h后，分别做AO染色和TUNEL染色。①AO染色：取出盖片，温Hanks液漂洗3～5 s；95%酒精固定15～30 min；1%冰醋酸作用30 s；1×10-4吖啶橙染色30 s～1 min；0.1 mol/L CaCl2处理30 s～2 min；PBS漂洗3次，封片。镜下观察并摄影。②TUNEL染色（按试剂盒内的说明书进行操作）：取出盖片，3.7%中性甲醛液室温固定10 min；cytonin15 min，3% H2O2抑制内源性过氧化物酶5 min；TDT标记反应液37 ℃，1 h；抗-Brdu 37 ℃，1 h；Streptavidin-HRP 10 min；DAB显色，苏木素复染。镜下观察并摄影。

1.2.4 细胞增殖实验：取对数生长期的子宫内膜癌细胞，制成浓度为1×105个/mL的单细胞悬液，接种于96孔培养板中，每孔200 μL，过夜贴壁后，4 ℃培养1 h，以促进细胞同步化生长；换培养液，实验组分别加入10-8、10-7、10-6、10-5mol/L的培养液，对照组加纯培养液。每一浓度均设4个复孔，培养72 h后，每孔加入20 μL浓度为5 mg/mL的MTT溶液，继续孵育4 h后吸净上清夜，每孔加入二甲亚砜200 μL，振荡10 min，用酶标记光度仪在波长为492 nm时测定每孔的吸光度（A）值，计算不同浓度孕酮对细胞生长的抑制率[抑制率=（对照组A均值-实验组A均值）/对照组A均值]。本实验重复3次。

2 结 果

2.1 孕酮对子宫内膜癌细胞周期分布和凋亡率的影响：经FCM分析，不同浓度孕酮作用肿瘤细胞72 h后，与对照组相比，细胞周期分布、凋亡率均发生改变，即G0/G1期细胞比例数上升，S期和G2/M期下降，细胞凋亡率上升，均有显著差异，且与孕酮浓度之间具有剂量依赖性，即呈显著正相关。

2.2 子宫内膜癌细胞凋亡形态学变化：①AO染色：凋亡细胞体积明显缩小，核碎裂，核内可见浓缩边集的染色质，呈新月形或肾形致密浓染的黄绿色染色，荧光亢进。②TUNEL染色：细胞核经苏木素复染呈浅蓝色，核相对较大，形态较为一致。凋亡细胞断裂的DNA片段末端经标记后显色，核呈棕色或棕褐色，表现为固缩、边集、碎裂，可见凋亡小体形成。

2.3 孕酮对子宫内膜癌细胞增殖的影响：MTT结果显示，随着孕酮浓度的增加，其对细胞生长的抑制作用明显增强，与对照组比较，差异有显著性，且具有剂量依赖性，抑制率与孕酮的浓度之间呈显著正相关。

3 讨 论

3.1 孕酮对子宫内膜癌细胞生长的影响：本研究选用的是高分化子宫内膜腺癌细胞，且为PR阳性，提示子宫内膜癌是性甾体激素依赖性肿瘤。Ishiwaia等在研究孕激素对人类内膜癌细胞系生长和分化作用时发现体外孕激素可抑制癌细胞的生长。本实验MTT结果证实，随着孕酮浓度的增加，其对细胞生长的抑制作用明显增强，与对照组比较，差异有显著性，且具有剂量依赖性。

3.2 孕酮对子宫内膜癌细胞凋亡的影响：细胞凋亡的发生往往是细胞先被阻滞在细胞周期的某一时相，然后发生凋亡[1]。在一些体外实验中，也已经证实可通过诱导细胞凋亡清除某些肿瘤细胞，而认为孕激素促进凋亡可能是依赖PR机制影响了抗凋亡基因蛋白的表达。本实验用FCM法观察了不同浓度孕酮对内膜癌细胞周期分布及凋亡的作用，发现孕酮改变了细胞周期的分布，使细胞周期出现向G0/G1期移行的特征性动力学改变，即G0/G1期细胞明显增多，S期减少，并可诱发细胞凋亡。当孕酮浓度在10-5 mol/L时，细胞周期分布显示G0/G1峰前出现一个小于二倍体DNA含量的亚二倍体峰，即细胞凋亡峰。因此，我们可以推断孕酮是通过在G0/G1→S间阻断内膜癌细胞周期的进程，诱导癌细胞凋亡而抑制子宫内膜癌细胞的增殖。同时我们在光镜下也观测到了癌细胞凋亡的形态学上的典型特征。

3.3 孕激素对子宫内膜癌细胞的作用机制：孕激素治疗子宫内膜癌的历史已有40多年，至今机制不明。一般认为孕激素对癌细胞有直接抑制作用，在外源性孕激素作用下，子宫内膜癌细胞分化趋向成熟，分泌活跃，细胞发生凋亡和萎缩[2]。目前，对于孕激素治疗子宫内膜癌作用机制的研究主要涉及以下几个方面：①基因水平：有研究[3]发现，子宫内膜癌孕激素治疗过程中，bcl-2基因表达均发生降调节，并伴随着肿瘤细胞分化逐渐成熟，从而认为bcl-2可作为子宫内膜癌孕激素治疗效果的一个标记。②细胞因子：实验显示孕激素可直接作用于内膜样腺癌细胞的血管内皮生长因子（VEGF）的基因转录，消除雌激素对内膜血管内皮生长因子mRNA表达的抑制作用，同时抑制内膜细胞的血管生成多肽mRNA表达[4]。还可减少子宫内膜癌细胞表面的硫酸酯，从而减少细胞与层粘连蛋白结合，降低肿瘤的侵犯和转移能力。③性激素结合球蛋白和酶：孕激素可通过影响性激素结合球蛋白对子宫内膜癌发生作用。也有文献报道，谷光甘肽过氧化物酶，雌激素磺基转移酶，17B-羟甾脱氢酶芳香硫基转移酶等可能在孕激素对子宫内膜癌的治疗中发挥作用。④细胞增生与分化：许多研究指出，孕激素治疗可减低子宫内膜癌的细胞增生，促使其分化，从而发挥治疗作用。Saegusa[5]等发现，孕激素治疗并不影响肿瘤细胞凋亡，而是通过促使细胞分化来抑制子宫内膜癌细胞增生，使组织动力学向癌细胞缺失的方向移动。

本实验通过孕酮对子宫内膜癌细胞增殖及凋亡的作用结果，提示了合理剂量的孕酮的应用对内膜癌患者的激素替代治疗有极大的益处，也希望本实验能为寻求肿瘤治疗的新方法提供一定的实验依据。（如将孕激素与细胞周期阻滞药等抗癌药物耦联成生物制剂，既能阻断癌细胞与细胞外基质的黏附，抑制肿瘤浸润性生长，又可以将之阻滞于某一细胞周期，抑制其增殖，诱导细胞凋亡，从而达到治疗癌症的目的。）

[1] 曾益新.肿瘤学[M].北京:人民卫生出版社,1999.

[2] 陈晨,华祖穆,金晓龙,等.孕激素治疗子宫内膜癌的形态学观察与治疗机制探讨[J].中华妇产科杂志,1997,32(7):415.

[3] Saegusa M,Okayasu I.Down-regulation of bcl-2 expression is closely related to squamous differentiation and progesterone therapy in endometrial carcinoma[J].J Pathol,1997,182(4):429-436.

[4] Zhang L,Rees MC,Bicknell R.The isolation and long term culture of normal human endometrial epitbelium and stroma,expression of m-RNAfor angiogenic polypeptides basslly and on oestrogen and progesterone challenges[J].J Cell Sci,1995,108(2):323.

[5] Saegusa M,Okayasu I.Progesterone therapy for endometrial carcinomas reduces cell proliferation but alter apoptosis[J].Cancer,1998, 83(1):111-121.

R737.33

B

1671-8194（2017）19-0053-02