艰难梭菌分子分型方法研究进展

李志荣赵建宏

(1 河北医科大学第二医院, 河北 石家庄 050000；2 河北省临床检验中心, 河北 石家庄 050000)

·综述·

艰难梭菌分子分型方法研究进展

李志荣1, 2赵建宏1, 2

(1 河北医科大学第二医院, 河北 石家庄 050000；2 河北省临床检验中心, 河北 石家庄 050000)

艰难梭菌; 分子分型; 分子流行病学

艰难梭菌(Clostridiumdifficile, CD)是一种革兰阳性厌氧芽孢杆菌，20世纪80年代发现它是引起抗生素相关性假膜性肠炎的原因之一，由其引起的艰难梭菌感染(Clostridiumdifficileinfection, CDI)现已成为抗生素相关性腹泻的主要原因[1-2]。CDI可表现为从轻度的自限性腹泻到严重的假膜性肠炎甚至死亡。在过去的十多年中，CD的流行病学情况发生了变化，自2004年起在北美和欧洲相继出现了CD强毒株：NAP-1/027/ST1[3-4]。到2008年，又发现了另一强毒株PCR RT078/NAP 07-08/ST11的传播流行[5]。快速、准确的分子分型对CD暴发流行的早期监测和追踪溯源具有重要意义。本文对常用的CD分型方法及其最新研究进展进行综述。

1 CD分型的历史回顾

CD常用的分型技术可分为2类：表型分型和基因型分型。血清型分型法是20世纪80年代中期常用的表型分型方法，采用玻片凝集的原理，该方法最初能够分出6个不同的CD血清型[6]，经进一步改进后可分出15种型别[7]。传统的其他表型分型方法还包括免疫印迹法分型[8]、细菌素/噬菌体分型[9]、抗菌谱分型[10]等。表型分型方法比较直观，但是具有重复性低、分型率低和分辨力不足等缺点。20世纪90年代出现基因分型技术，因其具有更好的分型率和分辨力，使之逐步取代表型分型技术[11]。基因型分型技术分为基于电泳条带和基于序列2种类型。最常用基于电泳条带型的技术包括限制性内切酶分析(restriction endonuclease analysis, REA)、脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis, PFGE)、毛细管或常规PCR核糖体分型(PCR-ribotyping, PCR RT)和多位点可变数目串联重复序列分析(multiple locus variable-number tandem repeat analysis, MLVA)。近年来被实验室推崇的基于序列分析的分型技术为多位点序列分型(multilocus sequence typing, MLST)。此外，以序列分析为基础的全基因组测序技术(whole genome sequencing, WGS)也逐渐兴起，成为研究CD菌株之间差异(如单核苷酸多态性分析)的分型技术。

2 常用的CD分型方法

2.1 PCR RT PCR RT是CD最常用的分子分型技术之一。由Gürtler等人首次创建，分型依据是根据16S和23S rDNA之间的间隔区变异性(intergenic spacer region, ISR)[12]。所使用的引物以16S rRNA基因的3’端和23S rRNA基因的5’端保守区为目标设计。因为CD基因组包含多个16S—23S rRNA操纵子，其数量和间隔区大小的不同使得PCR扩增后产生不同的扩增产物，经普通琼脂糖凝胶电泳分离得到的电泳带型称为核糖体型。现在用于CD的PCR RT的引物有两种[13-14]。其中，Stubbs等人所描述的O’ Neill 引物比Bidet引物的分辨力更好。分辨力是指区分无关菌株的能力，其数据基于辛普森指数(Simpson index, SI)[15]。采用O’ Neill引物进行分型时，PCR产物的大小通常为250～600 bp，然后由琼脂糖凝胶电泳或最近研究的毛细管电泳分离，从而达到分型目的。在欧洲，PCR核糖型的命名原则是UK(United Kingdom)加三位数的后缀(如UK001)。毛细管电泳核糖型别则为前缀CE加上三位数的后缀(即CE001)。然而，由于PCR核糖体型别的判定需要与参考菌株进行电泳谱型对比，不易在实验室间统一实现。因此，当前很多实验室也会依据本实验室的菌株型别进行排序命名(如本实验室的型别命名以HB加上两位数的后缀而成)[16]。迄今为止，PCR RT能够识别400多种不同的CD类型。

2.2 PFGE分型 在北美地区，PFGE曾是最常用的CD分子分型技术之一。PFGE利用稀有酶切位点限制性内切酶(例如SmaI)对细菌染色体组DNA进行消化，通过在3个不同方向的脉冲电场，从而使细菌DNA片段得以有效分离。由于在电泳过程中的脉冲方向呈线性增加，可以逐步使更大的片段能够通过凝胶迁移，从而可以区分传统琼脂糖凝胶电泳下不能分辨的大片段DNA。PFGE所得到的指纹谱型被称为NAP型。型别类型使用前缀NAP(北美脉冲场型)后跟一个数字表示脉冲场型的分组和一个字母表示的亚组(即NAP 1b)。

尽管仪器设备昂贵，操作程序复杂和运行缓慢，但在美国PulseNet的大力推动下，PFGE分型方法仍在20世纪90年代成为北美地区大多数CD病原体的金标准。但是，由于细菌DNA的降解导致许多CD无法被分型。此外，PFGE的标准操作流程和应用还需要进一步的优化[17]。

有报道称PFGE比PCR RT具有更好的分辨力(SI值分别为0.843和0.688)[18]。然而，另一项关于PCR RT初步分型技术比对的研究中，最常见的39个PCR RT型，却只能被分为16个PFGE类型。所有基于电泳指纹图谱分型面临的共同问题是对电泳条带的识别，尤其是当条带的谱型差别不大的时候。因此，如何定义PFGE和PCR的不同型别对于识别新的型别非常必要。在欧洲，新的PCR核糖体型别常由参考实验室来验证。早期的20个PCR RT型分离自多个欧洲国家，遍布欧洲艰难梭菌感染研究网络(EuropeanClostridiumdifficileinfection surveillance network, ECDIS-NET)的各参考实验室[19]。

2.3 MLST分型 MLST于2004年首次用于CD群体构成和全球流行病学研究[20]。该方法是基于基因测序的分子分型方法，通常测序的片段是七个长度约在300 bp和500 bp之间的管家基因(MLST 7HG)。根据每个管家基因的序列变异情况，分配给它一个不同的等位基因编码，这样七个等位基因的编码组合就形成了一个序列类型(ST型)。将MLST分型方法产生的序列数据上传至一个全球实验室公用的Web数据库，即可方便不同实验室对ST型的确定、研究CD的群落构成和全球流行情况。目前，有2种不同的MLST分型方案[20-21]，这2种分型方案都包括7个管家基因，其中3个基因位点在2个方案中都被应用到(triosephosphate isomerase,tpi; recombinase A,recA; superoxide dismutase A,sodA)。后续研究发现Lemee方案中的丙氨酸连接酶(DDL)位点是一个无效的等位基因，因此应用较少。而Griffiths分型方案则被广泛应用[21]。据报道，MLST和PCR RT方法的分辨力是相当的[18, 21]。

相比基于电泳指纹图谱的分型方法(如PCR RT)，MLST更不容易受到基因重组的影响。一个管家基因的重组仅会改变单一基因位点，这使得即便产生了新的ST型，仍会与原始的ST型保持较近的亲缘关系，也就维护了系统进化分析的相关性。用MLST进行系统发育分析，可将CD至少分成5个不同的进化分支[21]，而位于第6个分支的菌株可能是单系进化[22]。多数ST型都属于第一分支，而且这一分支无主要的亚分支。导致这一结果的原因可能与分型方案选择的管家基因位点相关。选择不同的管家基因或者在当前的MLST方案中加入新的管家基因，或许可增加对位于第一分支的菌株的分析效果。

基于测序的MLST分型方法的一个主要优势是其所得出的数据易于解释。测序的数据比较明确、客观，具有高度重复性，并易于实验室间的交流。此外，不同实验室可将自己的测序数据提交至MLST数据库。截至2016年1月11日，数据库中已有可明确的331个ST型。MLST存在的比较现实的缺陷是其测序的成本相对较高，这可能是在许多欧洲实验室并未用MLST取代传统的PCR RT的原因之一。

2.4 MLVA MLVA是一种具有高分辨力的分子分型方法，通常被应用于研究细菌暴发流行和追踪病原体传播途径[5, 23-24]。其分型原理是通过软件寻找散在分布于细菌基因组中的大小不等的短串联重复序列(VNTR)，并设计相应引物对其扩增，用毛细管电泳自动分析扩增产物。根据其串联重复序列可变重复数目，分配给不同菌株一定的数组，据此判定为不同的MLVA型别。通过计算汇总串联重复序列的差异(summed tandem repeat difference, STRD)可构建最小生成树(minimum spanning tree，MST)。STRD≤2的菌株定义为一个克隆群，STRD≤10的菌种认为是一个基因相关群[5, 25]。Broukhanski等[25]研究发现艰难梭菌MLVA方案中有两个位点(F3和H9)在不同菌株间没有差异，表明这两个位点在CD分型上无任何作用。此外，Bakker等[26]报道，MLVA的A6位点对于PCR RT078是无效位点。因此，对PCR RT078型菌株的分析，需要进一步优化其他几个位点的PCR设置。目前，MLVA被认为是CD流行病学研究最有效的分型方法，并应用于荷兰、法国和英国的027型暴发流行研究。还有英国学者采用MLVA方法探讨了CDI病例的潜在联系[27]。值得注意的是，该研究结果显示，原本被认为是属于同一种群的菌株，几乎有一半是由无关菌株组成，或者是由相关和无关的菌株混合组成。

3 艰难梭菌分型方法的新进展

3.1 MLVA进展 有学者提出一个改进的MLVA(modified MLVA, mMLVA)方案，将MLVA与PCR检测艰难梭菌毒素基因相结合(tcdA,tcdB,cdtB和tcdC)[24]。该方案将MLVA位点数量限定为5个，去除F3和H9位点。尽管结合毒素基因检测后的分型方案信息量更大，但目前还无法将这些数据与PCR RT027/ NAP01等特定型别相关联。其原因可能是因为二元毒素基因与tcdC基因缺失的并存现象并不只存于PCR RT027菌株[24, 28]。而在Manzoor等[29]的研究中将MLVA方案所用的基因位点数目增加至15个，扩展后的MLVA(extended MLVA, eMLVA)方案可区分临床上的主要集群，与PCR RT具有良好的一致性。而仅含有7个位点的MLVA方案[25-26]与PCR RT相关性较差，7个位点MLVA只能结合PCR RT方法作为亚型分型方法使用，而eMLVA则可同时取代两者。但是，随着位点数目的增加，该方法也更费力，而且增加了数据的解释难度。

为创建一个可提供满意分析的数据，并与PCR RT保持良好的一致性MLVA方案，Wei等[30]筛选了40个MLVA位点用于研究CD暴发流行。研究结果表明，由多样性较低的等位基因位点组成的MLVA方案与PCR RT相关性高，而多样性较高的位点组成的分型方案则可用于CD暴发流行研究。这两个分型方案，分别包括10个多样性有限的等位基因位点和4个高度多样性的等位基因位点。

3.2 高分辨毛细管凝胶电泳核糖体分型(capillary gel electrophoresis-based PCR ribotyping， CE-PCR RT) 虽然PCR RT已经被许多欧洲实验室广泛应用于CD监测，但是由于指纹图谱的不易解释和缺乏标准化数据库等问题，这一方法的应用传播仍有较大局限。而CE-PCR RT的应用大大提高了其重复性和可解释性。例如，传统的基于琼脂糖凝胶电泳的PCR RT很难区分014型和020型CD。而CE-PCR RT则不仅可以区分014型和020型，还能将014型进一步分出亚型[31]。美国疾病控制与预防中心(CDC)、加拿大卫生公署、荷兰莱顿大学医学中心和英国利兹教学医院的CD监测，探讨了CE-PCR RT的DNA提取、引物设计、PCR循环条件及参考标准等操作流程，并采用标准一致的操作流程对70个不同的RT型进行了检测[24]。初步结果表明分型结果在不同实验室之间较为一致。

3.3 基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-light mass, MALDI-TOF MS)分型 MALDI-TOF MS以其在微生物的鉴定、耐药性和毒力监测中快速、准确、重复性好、高通量等特点，近年来越来越受到人们的关注。它不仅能够鉴定病原体种/亚种水平，还具有良好的分型能力，逐渐被应用到细菌、真菌和病毒的分型中[32]。其分型原理是建立在MALDI-TOF MS鉴定微生物的基础上，利用核心图谱(the main spectra, MSP)建造标准蛋白指纹图谱库，采用主成分分析(principal component analysis, PCA)进行数据处理。MALDI-TOF MS质谱图是以检测到的离子质荷比(m/z)为横坐标，离子峰强度为纵坐标构建而成，通过将检测到的病原体鉴定质谱图与标准数据库图谱比对，从而实现对目标微生物种或菌株的区分和鉴定[33]。图谱中主要的分子离子峰为菌体内高丰度、表达稳定、进化保守的核糖体蛋白，所以，可以通过聚类分析获得微生物间的进化和亲缘关系。Rettinger等[34]采用MALDI-TOF MS质谱指纹图谱分型方法、16S rRNA测序方法和MLST方法对28株钩端螺旋体进行进化分析，发现质谱指纹图谱能很好地区分高致病性(21株)、中间型(3株)和非致病性(4株)的钩端螺旋体。与16S rRNA测序方法得到的进化树结果相同，同一型内各菌株之间相似性很高，但MLST方法却只能区分中间型钩端螺旋体，高致病性和非致病性的菌株都归于一类。目前有研究人员正在探讨MALDI-TOF MS在CD分型中的应用[35]。

3.4 二元基因分型 二元基因分型是近年来用于微生物分型的一种新兴的分子分型方法，已经成功应用于金黄色葡萄球菌和空肠弯曲杆菌的流行病学研究[36-37]。其分型原理是根据某一个基因在细菌DNA的存在与否，都能将一组细菌分成2个类型，当结合多个这样的基因位点进行分析时就可将一组细菌进行有效的分型，这样的基因位点又被称为二元基因。如果选择的基因位点是与毒力和耐药等功能相关的基因时，二元基因分型方法不仅可追踪流行菌株的传播途径，还可让临床医生直观地了解从患者样本中分离到菌株的功能基因，以便采取进一步的治疗措施。近期，我实验室成功创建了CD二元基因分型方法，通过方法学对比研究发现，10位点二元基因分型不仅具有操作简便、费用低、易于分析和数据共享等优点，而且其分辨力也优于核糖体分型和MLST，显示了良好的应用前景。

3.5 WGS分型 高通量、全基因组测序技术应用的范围和可靠性已足以准确调查病原体的毒力、流行路径和菌群结构分布[38]。通过对成百上千的基因组系统发育学和比较基因组学分析，可准确地确定细菌的遗传学变化，而且容易发现遗传学与毒力和耐药性表型的关系，因此，可快速地了解病原体的生物学特征[39]。通过比较单个核苷酸的多态性，WGS可区分菌株间单个核苷酸水平的差别，因此具有极高的分辨力。另外，通过预测病原体出现的选择性压力和追踪病原体流行传播，WGS在临床微生物学和公共卫生流行病学领域也有很高的实用价值。

尽管WGS的应用仍然受到设备、数据分析等条件的限制，但该方法代表了病原体分型的终极方法。在未来几年，WGS将会成为一种常用CDI监测及流行病学工具。虽然与传统的分型方法相比WGS成本相对较高，但是随着CD基因组数据质量控制和后期的信息学、系统发育和谱系地理学分析等标准计算程序[40]的发展，WGS数据处理的成本正在迅速下降[12, 41]。此外，1次WGS检测得出的信息量可同时推断MLST、PFGE、耐药基因、毒素基因序列和其他数据，从这个角度来讲，它可以平衡成本效益，也预示着它可能是一种终极的分型方法。

首次应用高通量WGS测序技术对PCR RT027系统进化树研究结果显示，通过SNP分析可将采集自美国和欧洲的25个PCR RT027菌株进一步分成25不同的基因型。此外，该研究还发现美国和欧洲不同地区的菌株拥有独特的进化谱系和抗菌药物耐药基因。有证据表明[42]，PCR RT027型菌株获得相同的耐药突变后出现了两条不同的流行谱系，这两谱系在全球传播时呈现了不同的流行模式。Köser等[43]的研究将WGS测序在诊断学和流行病学研究中的应用显示了很好的效果。这项研究指出，基因组SNP分型主要可用于监测暴发和病原菌传播途径的识别。当前用于监测CD医院相关感染暴发的方法，比如PCR RT方法的分辨力有限，不能识别暴发流行的菌株是否来自同一克隆株，而全基因组测序则有很好的分辨力，可以追踪病原菌在医院，医院病房和同一个病房的患者之间的传播路径。

Eyre等[44]研究表明，WGS可产生实用的、与临床直接相关的数据，在一定时间内研究结果有助于患者管理，从而在疾病暴发初期实现感染控制。这项研究中通过WGS检测发现，由相同ST型CD造成的医院相关性艰难梭菌感染，实际上可能是一组相互间没有进化关系的CD所导致，因此可排除其在患者之间传播的可能。而且，与比较基因组学相结合，WGS是发现与潜在毒力相关的新的遗传标志的有效方法。这是一个超越传统分型方法的重要优点，因为传统方法只能利用现有的菌株特性标记进行分析。

5 未来展望

在过去的15年中，由于基于测序的分子分型方法具有较好的分辨力，以及分型结果的易于解释和相互交流，使其取代了一些更为传统的分型方法。而WGS则有可能主导未来十年的分子分型领域。然而，在WGS可作为分子分型的常规方法之前仍需要有更多的研究数据支持。首先，WGS需要在48 h内快速、有效地完成。其次，数据分析等技术流程仍需要进一步简化。最后，WGS技术的运行和组织平台成本必须降低。如果满足这些要求将大大增加WGS在全球的使用，这可能只是一个时间的问题。

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(本文编辑：熊辛睿)

Advances in molecular typing ofClostridiumdifficile

(LI Zhi-rong)1, 2, (ZHAO Jian-hong)1, 2

(1The Second Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050000, China； 2 Hebei Provincial Center for Clinical Laboratory, Shijiazhuang 050000, China)

2016-06-15

科技部课题资助项目(2005DKA21202-6)；河北省科技厅资助项目(10966142D)；河北省自然科学基金资助项目(H2013206450)

李志荣(1985-)，男(汉族)，河北省邯郸市人，主管检验师，主要从事临床微生物致病及耐药机制研究。

赵建宏 E-mail:zhaojh_2002@yahoo.com

10.3969/j.issn.1671-9638.2017.04.023

R378.8

A

1671-9638(2017)04-0377-06