睾丸间质细胞内调控StAR影响睾酮合成因素的研究进展

董伟航孙大林综述 金保方吴萍审校

1. 青海大学医学院（西宁 810001）；2. 东南大学附属中大医院 中西医结合男科

·综述·

睾丸间质细胞内调控StAR影响睾酮合成因素的研究进展

董伟航1孙大林2综述 金保方2吴萍1审校

1. 青海大学医学院（西宁 810001）；2. 东南大学附属中大医院 中西医结合男科

StAR（steroidogenic acute regulatory）是睾丸间质细胞（Leydig cells）内促进胆固醇作为睾酮合成前体从线粒体外膜转运至内膜的关键因子[1,2]，胆固醇在StAR的调控下通过线粒体外膜TSPO（translocator protein）与VDAC1（voltage-dependent anion channel 1）进入线粒体内膜，再经CYP11A1（cytochrome P450 family 11 subfamily A member 1）裂解其侧链成为孕烯醇酮，孕烯醇酮经线粒体与内质网内的3βHSD（3β-hydroxysteroid dehydrogenase）转化为孕酮，孕酮在内质网内被CYP17A1（cytochrome P450 steroid 17-α-monooxygenase）转化为脱氢表雄酮最后经17-βHSD代谢为睾酮[3]。本文从睾丸间质细胞胆固醇来源开始，以cAMP-PKA、Notch、ERK1/2、PI3K-AKt信号通路，非编码RNA及其他StAR影响因素展开综述，意在为今后国内睾丸类固醇合成实验研究提供思路与参照。

一、脂滴与睾丸间质细胞

与在脂肪细胞中占满几乎整个细胞容积并作为能量仓库的脂滴不同，睾丸间质细胞内的脂滴以小体积贮存形式短暂存在，其利用受黄体生成素诱导的类固醇合成过程调节[4]。脂滴内有一个被单层磷脂包围的胆固醇脂（cholesteryl ester，CE）核心，磷脂单层嵌有相关蛋白（PLINs、CIDEs、lipases、SNAREs、vimentin、Rabs、VDACs及一些类固醇生成酶）。间质细胞内的胆固醇优先来源于受激素刺激而从脂滴分离的游离胆固醇，而HSL（hormone sensitive lipase）是将胆固醇酯转换成游离胆固醇的主要中性胆固醇酯酶。通过HSL与vimentin及StAR的相互作用，游离胆固醇被转运到线粒体用于类固醇激素的合成[5]。

二、StAR相关通路及相关因子

（一）cAMP-PKA通路

cAMP-PKA通路是包括类固醇合成在内多种生理进程的调控者。

细胞内cAMP（3',5'-cyclicadenosine monophosphate）浓度受LH/CG受体LHCGR（the luteinizing hormone/chorionic gonadotropin receptor）、ACs（adenylyl cyclases）与PDEs（cyclic nucleotide phosphodiesterases）调控，LH与LHCGR结合促使ACs将ATP转换成cAMP，cAMP将其下游效应器PKA（protein kinase A）磷酸化并激活Creb（cyclic AMP-responsive element-binding protein），进而诱导StAR与CYP（cytochrome P450）家族表达以促进类固醇合成；而PDE4与PDE8抑制cAMP对PKA的磷酸化作用。PKA还可磷酸化PLIN1、StAR与HSL以促进CEs水解[6]。

Nur77由Nr4a1基因表达，是孤核受体超家族中的一个转录因子，其作为端点效应器作用于PKA信号通路上促进StAR表达乃至类固醇合成[7]。本研究小组前期实验已证实，用AD-siNur77阻断Nur77后，StAR与3βHSD的表达明显下降[8]。而另有研究证实20αHSD（20a-hydroxysteroid dehydrogenase）、3βHSD、P450c17与StAR的表达均受Nur77调控，而Nur77基因表达受ERα（estrogen receptor α）抑制[9]。

ARR19（androgen receptor corepressor-19kDa）是趋化因子与跨膜4超家族间的调节蛋白，ARR19基因在睾丸中大量编码一种19kDa的富含亮氨酸的疏水性蛋白（前列腺亦有适度表达）。ARR19在间质细胞发育早期阶段高表达之后逐步减少，ARR19的表达通过GATA-1转录因子及cAMP应答元件结合蛋白受LH-cAMP调控。ARR19作为抗类固醇生成因子，通过抑制Nur77诱导的类固醇生成酶基因的表达从而抑制睾丸类固醇合成。以腺病毒转染小鼠睾丸使ARR19过表达，可使小鼠睾丸与前列腺缩小，但精囊大小无明显变化。ARR19还可通过减少3βHSD、 P450c17（CYP17A1）及StAR的表达并抑制孕酮及睾酮分泌[10]。

有研究认为视黄酸亦在cAMP-PKA通路上起重要作用，视黄酸作用于RXR（retinoid X receptor）、LXR（liver X receptor）乃至RAR（retinoic acid receptor），促进cAMP-PKA磷酸化Creb，进而活化HSL、LXR与SREBP-1c（sterol regulatory element-binding protein-1c）以促进StAR转录与表达[11]。

（二）Notch通路

Notch基因可在睾丸及睾丸间质细胞内表达，在生殖腺发生过程中，Notch信号通路可调节睾丸间质细胞分化——抑制其通路可增加睾丸间质细胞数量；反之则减少睾丸间质细胞数量，过表达或沉默Notch都会引起睾丸畸形以及生殖细胞缺乏[12]。

NOTCHICD（the Notch intracellular domain）在辅因子RBPJK的作用下黏附于胞核DNA上从而激活其下游因子HES与HEY，其中HEY能与GATA组成复合体抑制诸如ANF、MHC及MIS等基因的表达。类固醇合成途径受SF1上调、Dax1下调，Notch信号通路可抑制SF1并增强Dax1的转录以抑制类固醇合成；GATA4在间质及颗粒细胞内都有表达，是类固醇合成途径基因（SF1、Cyp19a1、StAR、Hsd3b1、Hsd3b2及Cyp11A1）的正向调控者，而Notch可抑制GATA4介导的基因转录[12]。

SF1（steroidogenic factor 1，Ad4BP or Nr5a1）属于肾上腺与性腺核受体家族，其功能主要作用于肾上腺及丘脑-垂体-性腺轴。SF1敲除后，成年小鼠睾丸间质细胞成熟相关基因Sult1e1（estrogen sulfotransferase）、Vcam1（vascular celladhesion molecule I）与Hsd3b6（hydroxy-delta-5-steroiddehydrogenase, 3 beta- and steroid deltaisomerase 6）的转录完全阻断[13]，睾丸间质细胞内脂质堆积，StAR及CYP11A1表达显著减少（敲除两者之一亦表现为脂质堆积，同时敲除效果叠加），游离胆固醇的显著增加而雄激素明显降低[14]。

Dax1(dosage-sensitive sex reversal, adrenal hypoplasia congenita (AHC) and critical region on the X chromosome gene1)由Nr0a1基因表达，亦属于孤核受体超家族，它可以抑制SF1表达乃至类固醇合成[15]。

GATA转录因子是一锌指结构蛋白，GATA1/4/6主要在胚胎期于睾丸支持细胞（Sertoli cells）与睾丸间质细胞内表达，其中GATA4在睾丸的主要靶基因为性别决定基因Sry、Sox9、Dmrt1，肽激素分泌基因Inha、Inhb、Amh，促性腺激素信号通路基因Fshr、Lhcgr，类固醇激素的合成基因StAR、Cyp11a1、Cyp17a1，以及细胞间作用基因Clmp、Cldn11、Cx30.2。在睾丸支持细胞及间质细胞中，GATA-4可与SF1、LRH1（liver receptor homolog 1，NR5A2）、FOG1、FOG2协同作用[16]。

Wt1（the Wilms' tumor suppressor gene）编码一锌指结构核转录因子，Wt1直接沉默SF1启动子从而抑制SF1表达，而敲除Wt1则SF1表达上调且睾丸支持细胞与颗粒细胞的分化被阻断，相应的多数生殖嵴细胞分化为类固醇合成细胞（睾丸间质细胞与膜-间隙细胞）[17]。

（三）ERK1/2通路

ERK1/2（extracellular regulated protein kinases）是MAPK（mitogen-activated protein kinase）的亚族，本身包含在MAP3K-MEK-MAPK三级激酶通路中。

ERK1/2通路参与调节睾丸间质细胞类固醇合成，其本身受LH与LHR调控，抑制ERK1/2则cAMP诱导的类固醇合成受阻，敲除睾丸间质细胞内MEK1/2，StAR、HSD3B6、CYP17A1与Hsd17b3表达下降，Nr0a1表达上升，睾酮分泌下降但Creb1、Nr4a1与Nr5a1表达上升[18]。ERK1/2磷酸化后才具有相应活性，MKP-1抑制MAPK的磷酸化，黄体生成素与cAMP可促进ERK1/2的磷酸化并诱导MKP-1（MAPK phosphatase-1）的分泌。通过过表达与敲除MKP-1，发现上调MKP-1可减少8Br-cAMP与hCG对ERK1/2磷酸化的促进作用并减少StAR的蛋白表达乃至睾酮合成。而药物抑制ERK1/2活性则cAMP对Nr4a1信使水平以及启动子活性的提升作用亦降低。MKP-1亦可受应激诱导分泌[19]。

AMPK（adenosine 5'-monophosphate-Activated protein kinase）即AMP蛋白激酶，属能量调节关键酶。一组实验认为AMPK可激活睾丸间质细胞内睾酮分泌，并可通过抑制ERK1/2的磷酸化以上调3β-HSD、p450scc及StAR的蛋白表达，进而促进间质细胞睾酮分泌[20]。但另一组实验结果显示，活化的AMPK通过下调StAR与Nr4a1明显抑制cAMP诱导的类固醇合成，但却对SF1蛋白水平无影响[21]。

Annexin A5作为膜联蛋白家族成员，其在睾丸间质细胞内也有表达。Annexin A5在睾丸间质细胞内可上调 StAR、P450scc、3β-HSD与17β-HSD的表达和睾酮分泌，实验发现ERK1/2通路在Annexin A5加入后被激活，而抑制ERK1/2通路则Annexin A5的上调作用被阻断[22]。

炎性坏死因子TNF-α（tumor necrosis factor alpha）亦被发现在睾丸间质细胞类固醇合成中起负性调节作用，它通过JNK-ERK通路磷酸化并激活Dax1，同时下调StAR、3βHSD与17βHSD的表达以进一步抑制睾酮合成[23]。

（四）PI3K-AKt通路

PI3K-AKt通路在以往的研究中主要以抗细胞凋亡为主，但近几年的实验研究提示PI3K-AKt通路调控睾酮分泌的机制或与StAR相关。

FGF9（f broblast growth factor 9）在性腺发育过程中起重要作用，研究发现FGF9可以通过Ras-MAPK及PI3K通路上调睾酮分泌，并可进一步激活JNK、p38、ERK1/2以及AKt通路[24]。

Foxo（forkhead box class O）是应激、衰老、发育、胰岛素敏感性相关蛋白，PI3K磷酸化AKT进而磷酸化Foxo3的Ser24、Thr32、Ser56三个残端以促进其转录。黄体生成素处理的R2C细胞（间质细胞系），Foxo3磷酸化增加；PIK3敲除后，Foxo3对应磷酸化减少。当Foxo3过表达时，睾酮及StAR蛋白表达减少；而将Foxo3及一个StAR启动子同时转染HEK293细胞（外源基因研究细胞系），发现Foxo3可抑制StAR启动子活性[25]。

H2R（histamine H2 receptor）属于G蛋白偶联家族，一般认为其与细胞的增殖与分化相关。研究发现H2R可抑制间质细胞PI3K-Akt通路并激活ERK通路，刺激腺苷酸环化酶上调cAMP乃至PKA的表达[26]。而cAMP-PKA通路上调StAR的表达，暗示H2R促进StAR分泌的可能。

三、非编码RNA

非编码RNA（non-coding RNA，ncRNA）中存在着影响StAR活性的因子，已有实验证实部分miRNAs与睾丸间质细胞激素调节相关[27]。

如前面所述，vimentin与StAR共同参与游离胆固醇转运。mi-RNA 200c可以抑制vimentin的表达。以10-7M MBP（mono-butyl phthalate）处理睾丸间质细胞，StAR与vimentin表达均上升；而过表达mi-RNA 200c，睾丸间质细胞内孕酮分泌减少；沉默vimentin，孕酮分泌亦减少[28]。该实验提示mi-RNA 200c或可抑制StAR的表达。

长链非编码RNA（IncRNA）H19属于一个高度保守的印记基因簇，H19作为miRNA let-7的分子海绵，可下调let-7的活性。实验证实过表达H19能上调StAR的蛋白水平，且StAR mRNA的3'UTR段有let-7结合位点，用let-7转染小鼠睾丸间质细胞后StAR表达下降[29]。而RNA沉默蛋白Lin28a与Lin28b被发现可在小鼠睾丸间质细胞内表达，且两者能与let-7前体结合以阻断let-7成熟[30]，尚未证实Lin28可否通过下调let-7以上调StAR的表达。

实验发现miRNA mi R-140-5p与mi R-140-3p抑制睾丸间质细胞分化，mi R-140-5p/mi R-140-3p敲除小鼠与Notch敲除小鼠在睾丸间质细胞分化程度上极为相似[31]，提示mi R-140-5p/mi R-140-3p影响Notch通路进而调控StAR的可能。

四、其他影响因素

已有研究表明锌（Zn）是男性生殖必需的微量元素。在CD-1小鼠睾丸间质细胞中，ZnT7（Zn transporter 7）与StAR协同表达。缺锌饮食小鼠ZnT7表达下调，而P450scc与3βHSD的分泌降低，血清睾酮水平下降；ZnT7基因静默的hCG刺激下的睾丸间质细胞其StAR、P450scc及3βHSD表达均下降，孕酮表达亦降低[32]。

ALPK1（alpha-kinase 1）在小鼠睾丸表达丰富，已知睾酮能降低炎性细胞因子与黏附分子的表达以达到抗炎效果。ALPK1转基因小鼠睾丸与血清睾酮含量均降低，而降低内源性ALPK1则能提高TM3间质细胞系睾酮水平及上调睾酮正向基因（P450scc、3βHSD、 P450C17、17βHSD、StAR及INSL3）的表达；反之则提高睾酮水平则TM3间质与THP1单核细胞系的ALPK1表达下降，且炎性细胞因子亦伴随减少。提高ALPK1水平还能拮抗睾酮在THP1细胞内的作用。ALPK1还能增加TNFα与TGFβ的分泌，而睾酮拮抗其对TNFα与TGFβ的上调作用[33]。

Nesfatin-1是前体蛋白NUCB-2 N端的神经肽，于雄性大鼠主要分布于下丘脑、腺垂体和睾丸间质细胞内。侧脑室注射Nesfatin-1后，下丘脑GnRH、Kiss1，垂体FSHβ、LHβ和睾丸StAR的基因水平均明显下降。青春期大鼠睾丸3βHSD、17βHSD、P450scc的基因水平显著提升，但成年大鼠睾丸相应基因水平与血清卵泡刺激素、黄体生成素与睾酮浓度明显降低[34]。

糖尿病严重影响男性生殖。AGEs（advanced glycation end products）明显抑制以hCG诱导的大鼠睾丸间质细胞内睾酮的分泌，并明显下调StAR、3βHSD和P450scc的蛋白与mRNA表达。抗氧化剂NAC（N-acetyl-L-cysteine）与内质网应激抑制剂TUDCA（tauroursodeoxycholic acid）可逆转AGEs的抑制作用。AGEs处理的睾丸间质细胞内ROS（reactive oxygen species）明显上升，应激相关蛋白CHOP（C/EBP homologous protein）与GRP78（glucose-regulated protein 78）的蛋白表达显著上调。可知AGEs通过诱导氧化应激与内质网应激以抑制大鼠睾丸间质细胞睾酮分泌[35]。

肥胖状态同时增加短期与长期肥胖大鼠的血清雌二醇（E2）和瘦素水平，抑制长期肥胖大鼠StAR和CYP11A1基因的表达并使长期肥胖大鼠睾丸内睾酮保持在低水平状态。此外，长期肥胖会降低睾丸间质细胞的数目，升高睾丸促炎脂肪细胞因子TNF-α水平并增加睾丸巨噬细胞数量。可知长期肥胖可能诱发睾丸慢性炎症并对睾丸间质细胞类固醇激素合成造成负面影响[36]。

应激（stress）可诱发肾上腺素与糖皮质激素快速上升，并使睾酮分泌急速减少；但反复应激刺激下，黄体生成素分泌虽然下降但睾酮分泌回升。肾上腺素受体(adrenergic receptors,ADRs)参与雄激素代谢，应激可诱导睾丸间质细胞内所有ADRs的表达提高，包括α1-ADRs，肾上腺素诱导的α1-ADRs能通过 PRKA、 ERK1/2和PI3K通路下调睾丸间质细胞中Nur77的转录并上调Arr19及Dax1的转录。以IMO法（immobilization stress）制造应激大鼠模型，部分模型鼠造模前睾丸注射哌唑嗪（prazosin阻断α1-ADRs），发现α1-ADRs阻断后，10×IMO大鼠睾酮回升，StAR的上升趋势亦被阻断，LHcgr转录减少，原本表达下降的Nur77转录升高，而原本上升的Arr19及Dax1表达下降[37]。

由松果体分泌的褪黑素（melatonin）是生物节律蛋白。研究褪黑素对松果体切除术后小鼠及其间质细胞的作用，发现松果体切除术后小鼠血清睾酮含量上升，间质细胞cAMP水平上升，Insl3、Per1、StAR、Hsd3b1/2、Nr4a1基因表达上升，ARR19基因表达下降，Per2节律表达消失，而在下丘脑-垂体水平Gnrh、Lhb及Mntr1a的表达提升；而加予褪黑素处理后，动物水平基因表达改变均恢复，但间质细胞层面时钟基因及类固醇生成基因无明显变化[38]。

五、讨论与展望

围绕睾丸间质细胞内的StAR相关通路，cAMPPKA与Notch通路的研究已较为成熟，可以预见未来在这两条通路上的实验研究会继续横向纵深多元发展；ERK1/2通路实验尚未明确ERK1/2与StAR及上游相关因子的作用机制，短期内实验仍应以通路机制研究为主；PI3K-AKT通路研究刚刚起步，以现有实验结果可预期其与StAR关系密切，可以适度横向铺展。围绕睾丸间质细胞内ncRNA调控StAR表达的研究虽少，但我们已能看到其中更深的研究价值。微量元素、炎性反应、神经调控、糖尿病、肥胖、应激、生物节律，看似独立的StAR影响因素亦可联系起来，譬如应激实验就提示α1-ADRs可能作用在Nur77与StAR之间上调StAR转录而负反馈于Nur77，其与StAR抑制因子Arr19及Dax1间可能为拮抗关系；MKP-1亦可受应激诱导，ERK1/2通路实验的不稳定结果是否能与应激实验联系起来。以此类思考为出发点展开研究，不但可以为睾酮代谢异常、性功能障碍乃至男性不育症等临床研究提供实验扩展，更可为多病种之间的发病机制以及交叉机制的研究提供思路。

致谢：本课题由国家自然科学基金（编号：81403402；81473678）项目资助。

间质细胞; 睾酮; StAR; 信号通路;非编码RNA

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（2017-02-08收稿）

:10.3969/j.issn.1008-0848.2017.02.015

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