玉米基因组DNA不同提取方法及提取部位的比较研究

楚海娇

（吉林农业科技学院生物工程学院，吉林 吉林 132101）

玉米基因组DNA不同提取方法及提取部位的比较研究

楚海娇

（吉林农业科技学院生物工程学院，吉林 吉林 132101）

分别探讨CTAB法和SDS法对玉米不同部位基因组DNA的提取效果。综合比较了2种方法提取的DNA浓度、纯度及完整性，结果表明SDS 法是比较适合玉米基因组DNA提取的方法；同时比较了以玉米叶片、幼根和成熟胚为材料提取的DNA质量，发现以新鲜叶片为材料提取的DNA浓度和纯度较高，更适合用于玉米基因组DNA的提取。

玉米；基因组DNA；CTAB法；SDS法

基因组DNA是生物体所有遗传信息的总和。植物总DNA的提取是研究植物DNA的结构和功能，开展外源DNA转化和转导的前提。玉米是重要的粮食和饲料作物[1]。目前，国内外已开展了大量的玉米分子生物学研究和基因组学研究。研究玉米基因的结构与功能，发现具有目标性状的基因资源，探明基因位点与效应，可解决一些育种问题；同时通过转基因育种的使用，可实现物种之间跨越[2]。

进行玉米生物技术研究的基础是大量高质量、高纯度的玉米基因组DNA的提取[3]，提取的DNA浓度和质量对后续试验结果有较大的影响，因此合适的DNA提取方法非常重要。目前用于制备基因组DNA的方法很多，用于植物基因组提取的方法有CTAB法、SDS法及尿素法等[4]。对于玉米来讲，不同部位的材料、不同提取方法，DNA的得率不同。适宜的DNA提取方法不仅能够获得产量高、纯度高、完整性好的DNA，同时也应具备操作程序简便、快速、成本低的特点。

1 材料与方法

1.1 试验材料

玉米材料为“吉科3536”，由吉林农业科技学院植物科学学院提供。玉米种植采用盆栽法，待玉米长至2叶期时取不同部位，用于DNA的提取纯化。

1.2 主要试剂和药品

CTAB提取液、SDS提取液、饱和酚、氯仿、异戊醇、5M KAc、无水乙醇、TE缓冲液、5xTBE电泳缓冲液、6x凝胶上样缓冲液、DNA Marker、核酸染料。

1.3 试验方法

1.3.1 CTAB法

0.3g玉米材料液氮中研磨→加入CTAB提取液800uL→65℃水浴中提取→有机溶剂抽提2次→无水乙醇沉淀DNA→70%乙醇洗涤沉淀→RE缓冲液溶解DNA。

1.3.2 SDS法

0.3g玉米材料液氮中研磨→加入SDS提取液800uL→65℃水浴中提取→有机溶剂抽提2次→无水乙醇和5mol/L KAc沉淀DNA→70%乙醇洗涤沉淀2次→RE缓冲液溶解DNA。

1.3.3 基因组DNA浓度和纯度的测定

采用紫外分光光度法进行定量分析。取1uLDNA样品滴加于超微量紫外可见分光光度计Bionano上，测定玉米基因组DNA在260nm和280nm紫外光波长下的吸光度值。由吸光度值计算核酸分子浓度的公式如下：

dsDNA浓度（ug/mL）=OD260×50ug/mL×稀释倍数

基因组DNA纯度根据OD260/OD280的比值来衡量。纯净的DNA样品OD260/280在1.8～2.0之间，比值小于1.8，说明蛋白质或酚未除净；比值大于2.0，说明有RNA污染。

1.3.4 1%琼脂糖凝胶电泳进行基因组DNA完整性的检测

2 结果与讨论

2.1 不同方法提取玉米基因组DNA的结果分析

2.1.1 DNA浓度和纯度检测

使用紫外分光光度计分别对CTAB法和SDS法提取的玉米基因组DNA样品进行浓度和纯度测定，检测结果如表1所示。

表1 不同方法提取玉米DNA的浓度和纯度比较

由表1可知，CTAB法与SDS法相比，玉米不同部位提取的基因组DNA在纯度上均无较大差别，并且DNA的OD260/280都在最佳范围1.8～2.0之间，说明2种方法所提取的DNA样品纯度较高，基本上无RNA、蛋白质和多糖等杂质存在。

图1 CTAB法和SDS法提取DNA的浓度比较

由表1可知，CTAB法提取的玉米成熟胚、叶片及幼根的DNA浓度分别为：104.90ug/mL 、323.95ug/mL、148.20ug/mL；SDS法提取玉米叶片、幼根及成熟胚的DNA浓度分别为：152.50ug/mL、359.30ug/mL、191.45ug/mL。由图1可直观看出，对于相同玉米材料，采用SDS法提取的基因组DNA浓度均比CTAB法提取的浓度高，因此，SDS法更适宜用作玉米基因组DNA的提取方法。

图2 不同方法提取的玉米基因组DNA电泳图谱

2.1.2 琼脂糖凝胶电泳检测

从图2可以看出，采用CTAB法和SDS法提取玉米叶片基因组DNA的电泳条带都比较清晰，说明均获得了一定量的DNA。SDS法提取的玉米叶片DNA条带明亮且无拖尾痕迹，说明DNA含量较高；CTAB法提取的玉米叶片DNA条带虽无明显拖尾，但条带较弱，说明DNA含量较低。由此得出SDS法是提取玉米基因组DNA较好的方法。

2.2 不同部位提取玉米基因组DNA的结果分析

2.2.1 DNA纯度和浓度检测

使用紫外分光光度计分别对SDS法提取的玉米成熟胚、叶片及幼根基因组DNA样品进行浓度和纯度测定，检测结果如表2所示。

表2 SDS法提取的玉米不同部位DNA的纯度和浓度

由表2可知，玉米不同提取部位所提取的DNA含量存在一定差异。SDS法提取的玉米叶片DNA浓度为359.30ug/mL，达到分子生物学的要求高于200ug/mL。而从玉米幼根和成熟胚中所提DNA的浓度分别为191.45ug/mL 和152.50ug/mL，DNA含量相对较些，这主要是因为玉米成熟胚和幼根中的蛋白质、碳水化合物、淀粉等含量比新鲜叶片中高，而在DNA提取过程中，这些物质均被作为杂质除去，因此会影响到DNA的提取[6]。同时玉米不同部位基因组DNA的OD260/280均在最佳范围1.8～2.0之间，说明所提取的DNA样品纯度较高，基本上无RNA、蛋白质和多糖等杂质存在。从而说明玉米叶片较适宜作为提取玉米基因组DNA的材料。

图3 不同部位基因组DNA电泳图谱

2.2.2 脂糖凝胶电泳检测

由图3可知，以玉米叶片为材料，提取的DNA条带清晰明亮，无拖尾痕迹，从成熟胚和幼根中提取的DNA均无拖尾痕迹，但条带较弱，并且成熟胚中最弱，这可能是由于成熟胚中富含多糖类等储藏性成分，大大增加了提取DNA的难度，同时由于成熟胚经液氮处理后比较坚硬，研磨时可能造成了DNA的降解。由此可见，新鲜叶片更适合作为玉米基因组DNA提取和分子生物学研究的材料。

3 结论

提取高质量的DNA样品是进行分子生物学研究的的关键步骤。本试验为了得到优良的玉米基因组DNA提取方法及适宜的玉米材料，分别采用CTAB法和SDS法对玉米叶片、幼根及成熟胚3个不同部位的基因组DNA进行提取，通过检测发现，SDS法提取玉米叶片基因组DNA可获得高纯度、高浓度的DNA。此认为SDS法是提取玉米基因组DNA较好的方法，新鲜叶片更适合作为玉米基因组DNA提取的材料。在试验中应将玉米DNA的不同提取方法与所用材料结合起来考虑。

为了获得高质量高纯度DNA，在选取材料时应尽量选取新鲜的实验材料，因为新鲜材料次生代谢产物少、DNA含量高[7]；在加入液氮研磨时，速度要快，研磨要充分并始终保持材料的超低温状态，避免DNA的降解和酚类氧化；在转移上清液时应避免将中间层吸起，以减少杂质的吸入量；在DNA提取过程中，所有操作均需动作轻柔，避免剧烈振荡使大分子DNA断裂。本试验采用2种方法提取DNA时，均采用Tris饱和酚/氯仿/异戊醇和氯仿/异戊醇2次抽提，得到的DNA纯度较高。由此表明，此方法更能有效的去除蛋白质。

[1]魏琦超，畅丽萍，周岩，等.一种简便实用的玉米干种子基因组DNA提取方法[J].广东农业科学，2009(6)：165-167.

[2]贾继增.分子标记种质资源鉴定和分子标记育种[J].中国农业科学，1999，29(4)： 1-10.

[3]陈庆山，刘春燕，吕东，等.大豆DNA提取原理的探讨[J].东北农业大学学报，2004， 35(2)：151-153.

[4]周春阳，谢立波，李景富，等.辣椒叶片基因组DNA提取方法的研究[J].辣椒杂志，2011(3)：35-37.

[5]刘哲，刘庆平，孙霞，等.几种基因组DNA提取方法的比较研究[J].技术论坛，2011：68-72.

[6]陈丽丽，张鹏，黄新，等.玉米基因组DNA提取及浓度测定方法评价[J].生物技术通报，2011(12)：71-74.

[7]易庆平，罗正荣，张青林.植物总基因组DNA提取纯化方法综述[J].安徽农业科学，2007，35(25)：7789-7791.

S513

A

10.11974/nyyjs.20161232006