基于荧光效应和调色板均衡化的小球藻自动计数方法研究

刘世晶， 王 帅， 唐 荣， 陈 军， 刘兴国， 周海燕

( 中国水产科学研究院渔业机械仪器研究所，上海 200092)

基于荧光效应和调色板均衡化的小球藻自动计数方法研究

刘世晶， 王 帅， 唐 荣， 陈 军， 刘兴国， 周海燕

( 中国水产科学研究院渔业机械仪器研究所，上海 200092)

为实现藻类的自动计数，以小球藻为对象，提出一种基于荧光效应和调色板均衡化的小球藻自动计数方法。首先对小球藻荧光显微图像进行预处理，将真彩色小球藻荧光图像转换为256色图像，再采用调色板均衡化算法增强小球藻荧光图像对比度，并利用基于调色板的阈值分割算法将目标藻类与背景进行分割，同时进行计数。结果表明，该计数方法能够避免杂质影响，直接对藻类彩色图像进行图像增强和阈值分割，可以增强图像对比度，避免彩色图像灰度化过程中图像信息损失；采用连通区域标记方法结合连通区域的大小识别低重叠度藻类，可降低重叠藻类对计数结果的影响，从而提高小球藻的计算准确度。研究表明，该方法实现了针对藻类彩色图像的自动计数，且对小球藻的计数精度准确率达到95%以上，高于只使用灰度图像计数的方法。

均衡化；阈值分割；荧光；计数

小球藻(Chlorella)是一种高效的光合藻类。计算小球藻的数量在监测池塘、湖泊、水库等水体的水质状况时起着极其重要的作用[1-2]。随着机器视觉技术、图像处理技术的发展，利用荧光方法[3-4]和图像处理方法[5-8]进行动植物识别、品质检测、行为研究等技术已经广泛应用于农业领域，并在藻类检测方面得到了广泛应用[9-12]。Jukka等[13]根据一定浮游植物主要辅助色素在特定波长下的荧光强度，实现了对浮游植物门类的快速化学分类；Beutler等[14]利用浮游植物的叶绿素荧光光谱的不同特性，将浮游植物分为四大类进行识别。上述两种方法能够很好地鉴别藻类的门类，但很难实现藻类的精确计数。Peeh-Pacheeo等[15]应用图像捕捉处理方法对5种角藻进行自动识别和计数，该方法具有较好的分类和计数精度，但对具有相同外形的杂质识别度较差；另有一个将荧光分析与图像分析相结合的赤潮生物检测系统[16]，利用荧光图像和灰度图像的图像特点，实现藻类识别和计数，但图像处理主要依赖灰度图像，实际应用中容易丢失彩色图像中的有效信息，降低检测精度。

目前，尚未见到直接利用藻类荧光彩色图像进行计数的方法。为了降低彩色图像灰度化过程中图像有效信息的损失、提高藻类计数精度，提出了一种基于调色板均衡化小球藻计数方法，在不进行图像灰度化的情况下实现准确计数。

1 材料与方法

试验采用单一小球藻试验液，密度为600万个/mL。显微镜选择奥林巴斯BX51，配套荧光光源，观察倍数40×10。相机采用显微镜配套的DP71彩色CCD显微摄像机。利用分光光度计测量小球藻吸收光谱曲线，得到小球藻的吸收波峰在650 nm附近。根据小球藻的光谱特性，入射光源处选择中心波长420 nm、半波宽10 nm、透射率大于 50%的滤色片，接收口选择 680 nm 的高通滤色片，入射光源选取 40～50 W 的冷光源灯。计算机CPU主频为2.7 G，2 G内存，1 G显存。实验软件利用VC++6.0开发，基于XP系统。

采集图像为RGB格式，以256色BMP图像格式存储到计算机中。藻类图像如图1所示。

图1 小球藻荧光激发图像Fig.1 Image of chlorella fluorescence excitation

2 图像处理

2.1 图像调色板均衡化

利用式(1)[17]统计256色的小球藻显微荧光图像调色板中各颜色在图像中的概率密度函数。

(1)

式中：n—图像总像素数，pixels；Ci—归一化后不同颜色的色阶，级；ni—在图像中出现第L级灰度的次数，次；SL—处理后图像的归一化色阶，级；T(CL) —概率密度函数变换关系式；Pc(Ci)—为取第k级灰度值的概率。

利用公式(2)的变换关系均衡图像调色板中颜色，得到如图2所示图像。

CL=[(M-1)SL]

(2)

式中：L=0，1，…，n；M—图像中可能的灰度级总数，级；M-1—处理后图像的色级总数，级。

图2 调色板均衡化后图像Fig.2 Image after palette equalization

2.2 基于图像调色板的阈值分割

(3)

处理后的图像(图2)，增加了目标和背景的差异。调色板颜色直方图分布情况如图3所示。

图3 颜色直方图分布Fig.3 Color histogram distribution

红色小球藻点集中在0阈值附近，蓝色背景点集中在200和250阈值处，采用128处阈值作为固定阈值，阈值分割后的二值图像如图4所示。

图4 阈值分割后图像Fig.4 Image after threshold segmentation

2.3 藻类计数

分割后的图像，目标区域存在一些小的孤立点，因此利用开运算结合闭运算的方法，可以有效去除噪声，各部分的处理效果如图5所示。图5(b)的噪声点比图5(a)有所减少，小球藻图像更加清楚。对二值图像进行连通区域标记，每完成一次标记，记录该区域外接矩形面积，设置矩形面积上限值，根据面积阈值将计算重叠藻类数量(图6)，该算法能区分重叠部分较少的藻类图像，提高计数精度。

图5 各部分处理效果Fig.5 Treatment effect of each part

图6 重叠小球藻计数流程Fig.6 Process of overlapping chlorella counting

3 结果与分析

采用本研究提出的小球藻自动检测和计数方法对20幅不同浓度的藻类图像进行计数实验。首先采用人工计数方法精确统计一副图像中小球藻数量，以此为基准分别比较本文方法与基于灰度图像传统计数方法[19-20]，测定自动检测和计数的准确度，二者计数误差如图7所示。可以看出，在测试的20幅小球藻图像中，随着藻类浓度的增加，计数结果的误差逐渐增大。其中，使用本文算法在小球藻数量为75个以下时，误差为1个及以下，传统方法误差为1～3个；之后，随着小球藻数量的增多，2种方法的误差都会相应增加，本文方法的误差增幅明显小于传统计数方法。因此，本文算法的误差明显低于采用灰度图像计数的算法。

图7 两种算法计数结果误差曲线Fig.7 Error curve of two kinds of algorithm counting results

基于压片的藻类显微图像，由于光照、背景的不确定性，使得基于图像的计数方法主要停留在实验室阶段[21]。因此，本研究重点关注算法的鲁棒性和准确性。已有的研究成果，如对重叠的颗粒[22]、菌落[23]、粘连蚕卵[24]与粘连大米[25]进行计数，虽然这些方法适用范围广、分割结果较好，但容易发生过分割与欠分割的情况。

基于荧光效应和调色板均衡化的小球藻自动计数方法具有以下优点：(1)能够避免杂质影响，直接对藻类彩色图像进行图像增强和阈值分割，可增强图像对比度，避免彩色图像灰度化过程中图像信息损失；(2)采用连通区域标记方法结合连通区域的大小来识别低重叠度藻类，降低了重叠藻类对计数结果的影响，从而能够提高小球藻的计算准确度。由图7可知，采用该算法还存在一定的偏差，主要有以下问题：(1)藻类压片后存在分层现象，不同层面上的藻类荧光点在荧光图像中光强存在明显差异，甚至有些荧光点与背景之间的色度相当接近，特别是当藻类密度增加时分层现象更加明显；(2)当藻类数量增加时，出现藻类之间重叠的概率增大，虽然本文能够对低重叠度藻类进行识别，但当重叠度较高时，识别难度较大，导致计数误差。

4 结论

提出了一种基于调色板均衡化小球藻计数方法，在不进行图像灰度化的情况下实现藻类准确计数，通过对20幅不同浓度的藻类图像进行计数实验，结果表明：(1)该方法实现了针对藻类彩色图像的自动计数，且对小球藻的计数精度准确率在95%以上，高于只使用灰度图像计数的方法；(2)相较于彩色图像灰度化的藻类识别与计数方法，本文方法能有效降低图像特征损失，均衡后图像目标与背景对比度明显增强；(3)该方法根据藻类荧光特性，利用均衡化算法直接处理256色图像调色板，并采用连通区域标记方法结合连通区域的大小来识别低重叠度藻类，降低了重叠藻类对计数结果的影响，提高了计数精度。藻类重叠度较高时，如何提取多特征、如何改进算法来提高计数的精度，将是本文算法改进的一个重要方面，也是下一步的研究方向。

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Study on automatic counting method of Chlorella vulgaris based on fluorescence effect and palette equalization

LIU Shijing，WANG Shuai，TANG Rong，CHEN Jun，LIU Xingguo，ZHOU Haiyan

(Fishery Machinery and Instrument Research Institute,ChineseAcademyofFisherySciences,Shanghai200092,China)

In order to realize the automatic counting of algae, takingchlorella(Chlorellavulgaris) as the target, an automatic counting method based on fluorescence effect and palette equalization was proposed in this paper. Firstly, the fluorescent micrograph of chlorella was pretreated, by transforming it into 256-color images and enhancing its contrast by palette equalization algorithm. Then the target algae and the background were divided using threshold segmentation algorithm of the palette, and simultaneously counted. The results showed that this counting method could avoid the interference of impurities, directly realize the algae color image enhancement and threshold segmentation, increase the image contrast and avoid loss of image information during the process of color image graying; and by using the connected area marking method combined with the size of the connected region to recognize the algae of low overlapping degree, it reduced the influence of overlapping algae on the counting results, and thus could improve the calculation accuracy of chlorella. The experimental results show that this method can achieve automatic counting for algae color images, and the accuracy of chlorella counting accuracy is higher than 95%, which is higher than that of those methods using only gray scale image.

equalization; palette thresholding; fluorescence; count

10.3969/j.issn.1007-9580.2016.06.003

2016-07-17

2016-10-10

上海市科技兴农重点攻关项目(沪农科攻字(2014)第4-6-1号)；国家现代农业产业技术体系项目(CARS-47)

刘世晶(1982—)，男，助理研究员，硕士，研究方向：图像处理和模式识别。E-mail：lsjing2003@163.com

S951

A

1007-9580(2016)06-012-05