高效液相色谱-质谱法测定水中氯霉素效果分析

郭晓关，李 俊

(贵州省农产品质量安全监督检验测试中心，贵州 贵阳 550004)



高效液相色谱-质谱法测定水中氯霉素效果分析

郭晓关，李 俊

(贵州省农产品质量安全监督检验测试中心，贵州 贵阳 550004)

为建立水氯霉素残留检测方法，分析了高效液相色谱-质谱法测定水中氯霉素残留效果。结果表明高效液相色谱-质谱法测定水中氯霉素残留实验添加平均回收率为86.1%～92.1 %，相对标准偏差(RSD,n=6)为3.41%～4.57%；相关系数为0.9982；方法检出限为6×10-3μg·L-1，定量限为2×10-2μg·L-1，说明具有快速、准确、灵敏度高等特点，适用于水中氯霉素残留检测检测分析。

水;氯霉素;高效液相色谱-质谱联用仪

氯霉素(chloramphenicol，简称CAP)，由大卫·戈特利布(David Gottlieb)于1947年从南美洲委内瑞拉的土壤内的委内瑞拉链霉菌(Streptomyces venezuelae)成功分离，再于1949年合成并引入临床试验。它属抑菌性广谱抗生素，是世界上首种完全由合成方法大量制造的广谱抗生素，对很多不同种类的微生物均起著作用[1]。但是氯霉素有严重的副作用，它能抑制人体骨髓造血功能而引起再生障碍性贫血和粒状白细胞缺乏等疾病。因此，国内外都有相关法规,，来限定食品中氯霉素的最高残留量[2]。由于价格低廉, 早期曾被广泛用于人、畜多种传染性疾病的治疗, 我国上世纪80 年代开始在水产养殖业中得到广泛的应用，氯霉素的使用会照成在水产品中和水体中的残留，通过食物链最后对人类造成危害。

目前，针对水产品[3,4]、禽类[5,6]、蜂蜜[7,8]、牛奶[9,10]等对象的研究居多。水是生命之源，水之源有机污染物调查是环境保护的需要，因此急需建立一种经济、快速、灵敏、准确的水中氯霉素分析方法，提高分析效率，尽可能获取信息。氯霉素残留常规分析方法主要有微生物方法、高效液相色谱-质谱联用法和气相色谱-质谱联用法，微生物方法操作繁杂费时，只能做定性检测分析；高效液相色谱-质谱联用仪和气相色谱-质谱联用仪是目前最常用的定量方法。为此，建立了高效液相色谱-质谱法测定水中CAP残留量的方法，并进行了效果分析。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

试验使用样品水取于贵阳市花溪水库；水体如浑浊需取回需过滤后在试验使用。

高效液相色谱-质谱仪(4000 Qtrap LC-/MS/MS，美国ABI公司)；氮吹仪(美国 OI)。乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇、正己烷(色谱纯，美国 天地公司)，超纯水(实验室自制)；C18固相萃取柱(1000 mg/6 mL,美国Waters公司)；氯霉素标准品(美国 sigma公司)；

1.2 样品前处理

C18固相萃取小柱依次用5 mL二氯甲烷、甲醇、水活化平衡，将500 mL水样以5 mL/min 的速度连续上样到C18柱，氮气吹干，完成样品在C18柱上的富集，不收集上述所有滤液，最后用3 mL乙酸乙酯洗脱柱子，收集滤液，在40 ℃水浴氮吹至尽干，甲醇定溶至5 mL，LC-/MS/MS联用仪测定。

1.3 仪器条件

色谱条件 色谱柱：Kinebe C18色谱柱(100 mm×2.10 mm,2.6 μm)；流动相：甲醇/水(6/4，V/V)；流速0.5 mL/min；进样量2.0 μL；柱温(35 ℃)。

质谱条件 电喷雾正离子化源(ESI+)；毛细管电压(3.5 kv)；离子源温度(100 ℃)；雾化温度(300 ℃)；脱溶剂气(500 L/h)；多反应检测模式(MRM)扫描；定性离子对(320.9>257.0)，去簇电压(-55)碰撞能量(-16)；定量离子对(320.9>152.0)，去簇电压(-55)，碰撞能量(-26)；MRM色谱图见图1。

图1 氯霉素SRM色谱图Fig.1 SRM Chromatogram of the chloramphenicol

2 结果与讨论

2.1 水样提取与净化

采用C18反向固相萃取柱富集洗脱净化样品。洗脱液的极性强弱决定了样品的净化效果，目的是要使用最小量的洗脱液将氯霉素洗脱出来，而且还要防止杂质的大量流出。实验分别采用正己烷、乙酸乙酯、二氯甲烷、乙腈作为洗脱液净化已添加氯霉素的样品，考虑样品添加回收率及净化效果。在500 mL水样中添加5 μg氯霉素，分别用10 mL正己烷、乙酸乙酯、二氯甲烷洗脱C18反向固相萃取柱，收集液每1 mL收集一次，用甲醇溶剂置换后定容为1 mL上机检测，重复做3次，利用平均峰面积与流出体积作出洗脱液淋洗曲线图2。实验结果表明采用乙酸乙酯净化效果最好，当洗脱剂用量为3 mL时，样品添加回收均在90 %以上，因此选用3 mL乙酸乙酯溶剂为方法的洗脱条件。

图2 洗脱液淋洗曲线Fig.2 Eluent elution curves

2.2 质谱离子对选择

欧盟非强制执行法案[11]规定质谱检测中，最少需要3个识别点才能确认物质的定量和定性，选择1个母离子、2个子离子作为定性定量离子对，离子对参照GB/T 20756[12]标准。在相同的实验条件下，样品和标样中氯霉素保留时间偏差在±2.5%之内，且样品和相当浓度的标样中定性离子对的相对丰度比应满足欧盟非强制执行法案要求，可定性样品中有氯霉素检测，研究采用标准曲线外标法对样品进行定量分析。

2.3 干扰性实验

研究建立的方法主要应用于多种水体中氯霉素的检测，水体受污染的情况会对检测结果造成一定的干扰和影响，特别是对液相 法、气相法检测影响较大。实验在水里添加少量柴油模仿工业废水，在水里添加少量食用油、洗涤用品来模仿生活废水。分别在这两种水中加入1.0μg/L-1量的氯霉素，采用上述方法检测水样中氯霉素的含量分别为，模仿工业废水中检出0.82μg/L-1，模仿生活用水中检出0.87μg/L-1，两种模仿废水中氯霉素检出色谱图见图3和图4，从结果可知，方法的抗干扰能力强，对受污染较严重的工业废水、生活废水中氯霉素检测有很好的效果。

图3 仿生工业废水SRM色谱图Fig.3 SRM Chromatogram of the bionic industrial wastewater

图4 仿生生活废水添加样色谱图Fig.4 SRM Chromatogram of the bionic life wastewater

2.4 方法线性与灵敏度

配置质量浓度的为10、20、50、100、500 μg·L-1的标准溶液在实验条件下检测，以质量浓度与峰面积作线性回归，结果表明，氯霉素在10-500 μg·L-1范围内显线性关系，相关系数为0.9982。采用空白样品添加目标化合物的方法，依据特征离子质量色谱峰性噪比RS/N=3计算检出限，RS/N=10计算方法定量限，检出限为6×10-3μg·L-1、定量限为2×10-2μg·L-1(见表1)。

2.5 方法回收率和精密度

量取500 mL水样品，添加三个浓度水平(0.1 μg·L-1，0.5 μg·L-1，5.0 μg·L-1)的标样，每个浓度水平重复6次。利用上述方法进行添加回收率试验，平均回收率(R)和相对标准偏差(RSD，n=6)结果见表1。结果表明，氯霉素平均回收率为86.1～92.1 %，相对标准偏差(RSD,n=6)为3.41～4.57%，方法能满足样品检测需求，准确可靠。

表1 方法检出限、精密度和回收率

Table 1 Detection limits, precision tests and recoveries tests of the method

3 结论

研究建立的水中氯霉素残留检测方法，在实验条件下，样品添加平均回收率为86.1～92.1 %，相对标准偏差(RSD,n=6)为3.41～4.57%；方法检出限为6×10-3μg·L-1，定量限为2×10-2μg·L-1，说明方法具有快速、准确、灵敏度高等特点，适用于多种水体中氯霉素残留检测检测分析。

[1] 魏林阳,徐金晶,吴红军.水产品中氯霉素残留的气质联用法测定[J].光谱实验室,2007,24(2):201-205.

[2] Regulation ( EC)807P2001 Laying down a Community Procedure for the Establishment of Maximum Residue Limits ofVeterinary Medicinal Products in Foodstuffs of Animal Origin.

[3] 罗文婷,吴青,简伟明等.超高效液相色谱法测定水产品中违禁兽药氯霉素、呋喃唑酮和甲硝唑残留[J].分析化学,2009,37(6):100-103.

[4] 黄冬梅,于慧娟,李庆等. GC-MS测定水产品中氯霉素的残留量[J].分析科学学报,2006,22(1):70-72.

[5] 绕国璎,牛英娟,张之旭等. 反相高效液相色谱离子阱质谱法测定鸡肉中的氯霉素[J].分析实验室,2004,23(7):8-10.

[6] 何方奕,李铁纯,李学程等.固相萃取-高效液相色谱法测定鸡肉中氯霉素的残留[J].食品科学,2006,27(12):612-613.

[7] 谢文,丁慧瑛,章晓氡等.高效液相色谱串联质谱测定蜂蜜、蜂王浆中氯霉素残留[J].分析化学,2005,34(12):102-105.

[8] 权伍英,张秀丽,栾燕等. 液液萃取-液相色谱-串联质谱法测定蜂蜜中氯霉素[J].中国食品卫生杂志,1007,17(2):25-27.

[9] 田艳玲,王浩. 液相色谱-串联三重四极杆质谱测定牛奶中的氯霉素残留量[J].食品研究与开发,2011,32(3):133-135.

[10] 栗旸,和顺琴,薛景娇等. 超高效液相色谱-串联质谱法测定牛奶中的氯霉素残留[J].畜牧与饲料科学,2010,31(8):97-98.

[11] Commission Decision 2002/657/EC of 12 August 2002 implementing Council Directive 96/23/EC concerning the performance of analytical methods and the interpretation of result" (Official Journal L221, 17 August 2002, pp: 8-36).

[12] 庞国芳,林海丹,林峰等.GB/T 20756中国标准书号[S].北京:中国标准出版社,2006.

Analysis of Chloramphenicol Determination in Water by High Performance Liquid Chromatography-quadrupole Mass Spectrometry

GUO Xiao-guan,LI Jun

(GuizhouProvincialDetectionCenterofQualityandSafetyofAgri-Product,Guiyang, 550004,China)

The purpose is to establish the determination methods of chloramphenicol residues in water. analysis of chloramphenicol determination in water by high performance liquid chromatography - mass spectrometry. The results showed that using this determination method, adding recovery rate was 86.1 - 92.1%, the relative standard deviation (RSD, n=6) ranged from 3.41% to 4.57%; the correlation coefficient was 0.9982; the detection limit was 6 × 10-3μ g • L-1, and detection limit was 2 × 10-2μ g • L-1. The method is rapid, accurate and highly sensitive, and is suitable for the determination of chloramphenicol residues in water.

water; chloramphenicol; high performance liquid chromatography - mass spectrometry

2016-09-15

郭晓关(1982-)，女，农艺师，研究方向为农产品安全。

李俊，男，高级实验师，研究方向为食品安全及仪器分析。