补阳还五汤对去势脑缺血雌性大鼠海马神经干细胞增殖及ERK/CREB信号通路的影响

黄昕，周胜强，刘胜贤，张必超，薛科辉，刘柏炎，*

（1.益阳医学高等专科学校附属医院，湖南益阳413000；2.湖南中医药大学，湖南长沙410208）

补阳还五汤对去势脑缺血雌性大鼠海马神经干细胞增殖及ERK/CREB信号通路的影响

黄昕1，周胜强2，刘胜贤1，张必超1，薛科辉1，刘柏炎1，2*

（1.益阳医学高等专科学校附属医院，湖南益阳413000；2.湖南中医药大学，湖南长沙410208）

目的探讨补阳还五汤对去势脑缺血雌性大鼠海马神经干细胞（neural stem cells,NSCs）增殖及ERK/CREB信号通路的影响。方法采用双侧卵巢切除术(OVX)结合大脑中动脉阻塞（MCAO)法复制去势雌性大鼠脑缺血复合模型，将造模后的36只大鼠随机分为双假手术组、复合模型组、雌激素组、雌激素+G15组、补阳还五汤组及补阳还五汤+G15组6组，每组6只，术后24 h给予相应药物灌胃连续干预14 d，同时每天腹腔注射BrdU、G15分别标记增殖细胞和阻断GPER-1。采用免疫荧光BrdU/Nestin双标法检测各组大鼠缺血侧海马齿状回NSCs增殖情况，免疫组化SP法检测ERK1/2、CREB1磷酸化蛋白表达水平。结果补阳还五汤组和雌激素组缺血侧海马DG区BrdU/Nestin双标阳性细胞及pERK1/2、pCREB1阳性细胞表达均增加，与复合模型组比较有显著性差异(P＜0.05），但补阳还五汤组要多于雌激素组(P＜0.05)。与补阳还五汤组比较，补阳还五汤+G15组缺血侧海马DG区BrdU/Nestin双标阳性细胞及及pERK1/2、pCREB1阳性细胞表达均减少（P＜0.05）。结论补阳还五汤可以促进去势脑缺血雌性大鼠缺血侧海马DG区神经干细胞增殖，激活ERK/CREB信号通路，可能是其发挥类雌激素作用、促进内源性神经再生作用机制之一。

脑缺血；神经干细胞；ERK/CREB信号通路；去势大鼠；补阳还五汤

缺血性脑卒中是一种发病率、致死率和致残率均极高的脑血管疾病，虽然目前诊治技术不断提高，但尚无有效治疗手段[1]。神经流行病学研究结果表明，绝经前期妇女缺血性卒中的发病率及其严重程度远低于相应年龄段的男性，而绝经期后女性卒中发病率明显增高并且预后较差，女性绝经期后雌激素水平的下降与心脑血管病的发生有密切关系，故有学者提出雌激素在脑缺血中起着十分重要的作用[2]。

细胞外信号调节激酶(extracellular-signa1regulated kinase,ERK)/cAMP反应元件结合蛋白（cAMP responsive element binding protein,CREB）信号通路是所有真核细胞内将细胞外信号传导至细胞核引起增殖、分化等作用的共同信号途径[3]。越来越多的证据支持，除经典核内雌激素受体介导雌二醇（estrogen-2,E2）直接发挥基因效应外，该通路在神经系统中核外雌激素受体（estrogen receptor,ER）[如G蛋白偶联受体30(G protein-coupled receptor 30, GPR30)/G蛋白偶联雌激素受体1（G protein-coupled estrogen receptor 1,GPER-1)]介导的神经保护、神经再生等生物学效应中发挥重要作用[4]。

补阳还五汤是治疗缺血性脑卒中后遗症的经典方，有较好的临床疗效。但其是如何促进缺血后神经再生，恢复受损的神经功能，作用机制目前尚不完全清楚[5]。

课题组前期研究证实，补阳还五汤能够减少脑缺血大鼠脑梗死体积、促进神经功能恢复，上调血清E2、脑组织E2及ER水平，具有类雌激素作用[6]。因此，本研究拟以雌性去势脑缺血复合模型大鼠为研究对象，旨在深入探讨补阳还五汤对缺血海马内源性神经干细胞（neural stem cells,NSCs）增殖及ERK/CREB信号通路的影响。

1 材料与方法

1.1 动物

清洁级SD大鼠45只，♀，体质量（220±20）g，月龄2～3月，购自湖南斯菜克景达实验动物有限公司，生产许可证号：SCXK(湘)2009-0004；合格证号：004535。室温控制在（24±0.5）℃，自由饮食进水，昼夜光照节律，适应性喂养1周后用于实验。

1.2 药物

补阳还五汤（《医林改错》）：黄芪120 g，归尾6 g，赤芍4.5 g，桃仁3 g，红花3 g，地龙3 g，川芎3 g，饮片购自湖南益阳医学高等专科学校附属医院，煎药浓缩成生药浓度为2.6 g/mL；戊酸雌二醇片（拜耳医药保健有限公司广州分公司，1 mg/粒），研磨细粉后加入蒸馏水制成浓度为100 μg/mL的混悬液；GPER-1特异性阻断剂G15 (Chemicon公司)：用DMSO和生理盐水稀释成50 μg/mL的溶液（DMSO的终浓度为1 mmol/L）；BrdU（Sigma公司）：用DMSO和生理盐水稀释成20 mg/mL的溶液（DMSO的终浓度为1 mmol/L）的溶液。上述3种药物配制好后均于4℃冰箱避光冷藏备用。

1.3 主要试剂及仪器

通用型SP免疫组化试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：K156919F）；Rabbit Antiphospho-ERK1(Thr202/Tyr204)+ERK2(Thr183/ Tyr185)antibody（北京博奥森生物技术有限公司)；Rabbit Anti-phospho-CREB-1Rabbit Anti-phospho-CREB-1(Ser133)antibody（北京博奥森生物技术有限公司)大鼠抗BrdU单克隆抗体（Abcam公司）；兔抗Nestin单克隆抗体(Abcam公司)；Goat Anti-Rabbit IgG-FITC（Santa Cruz Biotech公司）；Texas Red-conjugated AffiniPure GoatAnti-Rat IgG+IgM（H+L）（Jackson公司）；进口羊血清工作液（北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：WP150926)；2、3、5一氯化三苯四氮哇(2,3,5-chloride Triphenyltin tetrazolylazo,TTC)(国药集团化学试剂有限公司，批号：20140825)；DAB染色液（北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：K152317J）；DAPI染色液（武汉博士德生物工程有限公司）；大鼠雌二醇ELISA试剂盒（上海劲马实验设备有限公司，批号：Wk30608）。硅胶包被线栓（规格：L3200，广州佳灵生物技术有限公司）；生物组织自动脱水机（湖北孝感市亚光医用电子技术公司，型号：ZT-12M）；石蜡包埋机（德国LEICA仪器公司，型号：EG1150H）；石蜡切片机（德国LEICA仪器公司，型号：RM2235）；摊片机（德国LEICA仪器公司，型号：HI1220）；倒置荧光显微镜（日本OLYMPUS公司，型号：BX43）；台式高速冷冻离心机（德国HERMLE公司，型号：Z32HK）；全自动酶标仪（芬兰Labsystems公司，型号：MK-3）。

1.4 复合模型的制备及评价

采用双侧卵巢切除术(ovariectomy,OVX)制备雌激素缺乏去势模型大鼠，在此基础上采用大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)法复制局灶性脑缺血模型，制成去势雌性局灶性脑缺血大鼠复合模型。

参照Zeynalov等[7]采用OVX术复制去势雌性大鼠模型。10%水合氯醛(3.5 mL/kg)腹腔注射麻醉后，腹位固定，腋下2 cm处剪毛备皮，75%酒精消毒，依次剪开皮肤、肌层及腹膜，用镊子深入切口处拽出卵巢切除，手术缝线结扎止血(假手术组的大鼠不摘除卵巢，仅在卵巢与输卵管连接处夹一下)，缝合切口。如法摘除另一侧的卵巢。从第五天开始随机选取6只大鼠断尾取血，隔天1次，ELISA法检测血清E2水平，含量低于5.0 pg/mL则确定为去势造模成功。15 d后将去势组所有动物再行MCAO术。

参照Longa等[8]MCAO法进行改良复制局灶性脑缺血大鼠模型。10%水合氯醛(3.5 mL/kg)腹腔注射麻醉后，将大鼠固定于手术操作台上，取颈部正中切口，游离右侧颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉。结扎颈总动脉、颈外动脉。于颈总动脉分叉部下方0.2-0.3 cm处剪一小口，将直径为0.32 mm的线栓插入颈内动脉，插入深度由分叉部计为约(18.0± 0.5)mm,固定线栓，依次关闭切口(假手术组仅切开皮肤、分离右侧颈总动脉后即缝合)。动物于清醒后2 h参照文献[8]进行神经功能评分，分值在1～3分者入组，死亡等原因剔除的动物予以随机替补。

1.5 分组与给药

将30只复合造模成功的雌性大鼠随机分为5组，每组6只:复合模型组、补阳还五汤组、雌激素组、补阳还五汤+G15组、雌激素+G15组。双假手术组6只。总共6组。

术后24 h各组给予相对应的药物干预：补阳还五汤组及补阳还五汤+G15组给予剂量为12.8 g/（kg·d）补阳还五汤灌胃，1.0 mL/只，每日1次；雌激素组及雌激素+G15组给予500 μg/（kg·d）戊酸雌二醇灌胃（70 kg成人临床等效剂量），1.0 mL/只,每日1次;复合模型组及双假手术组动物均给予等体积蒸馏水灌胃。连续给药14 d。所有组大鼠术后第一天起按100 mg/（kg·d）剂量腹腔注射Brdu[9]，1.0 mL/（只·d），连续注射14 d，标记增殖细胞。补阳还五汤+G15及雌激素+G15组按50 μg/（kg·d）剂量腹腔注射GPER-1特异性阻断剂G15[10]，1.0 mL/（只·d），连续14 d。双假手术组、复合模型组、补阳还五汤组、雌激素组每日均补足等量的载体液（生理盐水与1 mmol/L的DMSO）腹腔注射。

1.6 血清雌二醇ELISA检测

血清雌二醇水平采用ELISA法检测，具体过程严格按照试剂盒标准流程操作。

1.7 取材

各组大鼠在灌胃后第14天，末次灌胃及腹腔注射后4 h，各组大鼠用10%水合氯醛(3.5 mL/kg)腹腔注射麻醉，打开胸腔并暴露心脏，用注射用针头经心尖插入至主动脉端并固定好，剪开右心耳同时夹闭腹主动脉，用生理盐水约100 mL通过注射器快速滴入，待心脏无血污流出及前爪、肺部颜色也变白后，改用4%多聚甲醛约100 mL灌注，速度先快后慢，固定好后开颅取脑，去除小脑、嗅球和脑干只保留大脑组织，置于4%多聚甲醛中固定，4℃冰箱保存用于免疫组化及免疫荧光双标检测。

1.8 指标检测

1.8.1 免疫荧光双标法检测缺血侧海马DG区神经干细胞增殖情况常规组织脱水、透明、浸蜡、包埋、4 μm连续冠状切片，65℃烤片2 h后常规脱蜡至水，柠檬酸盐高温高压修复10 min，2 mol/L的HCl 37.0℃孵育30 min，0.1 mol/L硼酸漂洗10 min，5%羊血清封闭内滴加100 μL正常山羊血清室温封闭30 min，甩去不洗，同时加入大鼠抗BrdU单克隆抗体（1∶100）、兔抗Nestin单克隆抗体(1∶100)各50 μL，4℃冰箱孵育过夜，室温复温30 min，PBS洗5 min×3次，滴加Goat Anti-Rabbit IgG-FITC（1∶100）和Texas Red-conjugated AffiniPure Goat Anti-Rat IgG+IgM（H+L）（1∶100）荧光标记二抗各50 μL，室温避光孵育1 h，PBS洗5 min×3次，滴加DAPI染色液50 μL，室温避光孵育10 min，PBS洗5 min×3次，20 μL甘油封片，荧光显微镜下观察。同时用PBS代替一抗作空白对照以检查免疫反应的特异性。每只动物随机取5张切片，每张切片高倍镜视野(×400)观察左侧海马齿状回(dentate gyrus, DG)，用Image Pro Plus 6.0图像分析软件计算单位面积阳性细胞数，取其平均值作为该组神经干细胞增殖水平。

1.8.2 免疫组化法检测大鼠缺血侧海马DG区pERK1/2、pCREB1蛋白的表达严格按照通用型SP试剂盒标准流程操作。每只动物随机取5张切片，每张切片高倍镜视野(×400)观察左侧海马DG区，用Image Pro Plus 6.0图像分析软件计算单位面积阳性细胞数，取其平均值作为该组pERK1/2、pCREB1蛋白表达水平。

1.9 统计学分析

所有数据均用SPSS 17.0统计软件及Graph Pad Prism 5作图软件进行处理分析。计量资料用“±s”表示，组间比较，用单因素方差分析（One-way ANOVA）。分析前，先进行正态性和方差齐性检验，满足条件者用方差分析，方差分析有统计学意义者，再进行两两比较，两两比较方差齐者用SNIP法，方差不齐者用Tambane's T2法。当资料不符合正态分布时，采用多个独立样本比较的秩和检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义标准。

2 结果

2.1 复合模型判断

OVX术后，ELISA结果见去势组大鼠血清雌二醇水平随着时间的推移不断降低，术后第1天至术后第9天由（64.5±3）pg/mL下降至（4.1±0.5）pg/mL，小于5.0 pg/mL；假手术组大鼠血清雌二醇在（63.5±4）pg/mL范围内波动。说明去势造模成功（见图1）。且45只大鼠MCAO术后24 h，4只死亡，5只无明显神经功能缺损症状，36只均出现不同程度的神经功能缺损，评分在1～3分之间，故纳入研究。说明有36只大鼠去势局灶性脑缺血复合模型造模成功。

图1 OVX术后假手术与去势组大鼠血清雌二醇随时间变化情况（n=6，±s）

2.2 补阳还五汤对大鼠缺血侧海马DG区NSCs增殖的影响

各组大鼠缺血侧海马DG区免疫荧光结果显示：胞核呈红色荧光者为BrdU阳性细胞（增殖细胞），胞浆呈绿色荧光者为Nestin阳性细胞（NSCs），胞核呈蓝色荧光者为细胞核，Merge后呈枯黄色者为BrdU和Nestin双标阳性细胞（即增殖的NSCs）（见图2）。双假手术组海马DG区BrdU、Nestin阳性细胞少量分布，表达较弱，无双标阳性细胞；复合模型组可见少量双标阳性细胞。补阳还五汤组和雌激素组模型组双标阳性细胞均增加，与复合模型组比较差异有统计学意义(P＜0.05）（图2C、D），而补阳还五汤组要多于雌激素组(P＜0.05)。与雌激素组、补阳还五汤组分别比较，雌激素+G15组双标阳性细胞、补阳还五汤+ G15组双标阳性细胞均减少（P＜0.05）（见图2、表1）。

图2 各组大鼠缺血侧海马DG区NSCs增殖情况[免疫荧光BrdU(红)/Nestin（绿）双标，×400]

表1 补阳还五汤对大鼠缺血侧海马DG区NSCs增殖的影响（n=6，±s,个/mm2）

表1 补阳还五汤对大鼠缺血侧海马DG区NSCs增殖的影响（n=6，±s,个/mm2）

注：与复合模型组比较，*P＜0.05；与雌激素组比较，▲P＜0.05；与补阳还五汤组比较，△P＜0.05。

组别双假手术组复合模型组雌激素组补阳还五汤组雌激素+G15组补阳还五汤+G15组F值BrdU阳性细胞数3.62±0.91 6.93±1.83 14.82±4.21 25.21±4.60 7.89±1.43 14.32±2.54 -Nestin阳性细胞数2.96±0.51 5.12±1.51 15.41±3.16 26.76±4.87 8.54±1.26 15.57±2.31 -双标阳性细胞数2.50±0.21 4.36±0.62 11.62±2.78* 23.53±3.28*▲6.80±1.31▲13.34±1.76△32.16

2.3 补阳还五汤对大鼠缺血侧海马DG区pERK1/ 2、pCREB1蛋白表达的影响

各组大鼠缺血侧海马DG区免疫组化结果显示：pERK1/2表达主要位于细胞浆，pCREB 1表达主要位于细胞核，阳性细胞呈棕黄色或棕褐色（见图3）；双假手术组右侧海马DG区可见pERK1/2、pCREB 1一定量表达；复合模型组pERK1/2、pCREB 1表达稍增加。与复合模型组比较，补阳还五汤组和雌激素组pERK1/2、pCREB 1阳性细胞均增加，且差异有统计学意义(P＜0.05），但补阳还五汤组要多于雌激素组(P＜0.05)。与雌激素组、补阳还五汤组分别比较，雌激素+ G15组、补阳还五汤+G15组pERK1/2、pCREB1阳性细胞均减少（P＜0.05）（见图3、表2）。

图3 各组大鼠缺血侧海马DG区pERK1/2、pCREB1蛋白表达水平光镜图（免疫组化SP法，×400）

表2 补阳还五汤对大鼠缺血侧海马DG区pERK1/2、pCREB 1蛋白表达的影响（n=6，±s,个/mm2）

表2 补阳还五汤对大鼠缺血侧海马DG区pERK1/2、pCREB 1蛋白表达的影响（n=6，±s,个/mm2）

注：与复合模型组比较，*P＜0.05；与雌激素组比较，▲P＜0.05；与补阳还五汤组比较，△P＜0.05。

组别双假手术组复合模型组雌激素组补阳还五汤组雌激素+G15组补阳还五汤+G15组F值pERK1/2阳性细胞数224.31±13.42 243.42±23.76 463.90±45.82* 571.97±47.93*▲276.19±21.68▲284.29±27.96△65.40 pCREB 1阳性细胞数187.36±12.89 198.32±14.90 248.92±15.76* 289.46±29.13*▲212.14±16.80▲233.52±21.91△52.21

3 讨论

OVX术可以有效消除雌性动物体内雌激素对外源性雌激素及其类似物对其干预效应的影响；MCAO法是目前国际公认的模拟人类缺血性脑卒中的经典局灶性脑缺血造模方法。本实验在雌性大鼠成功去势的基础上采用改良的Longa线栓法造模，发现缺血后2 h大鼠均有不同程度的神经功能缺损，变异小，模型稳定可靠。OVX术结合MCAO法成功复制了去势雌性大鼠局灶性脑缺血复合模型。

既往研究表明在缺血脑组织中，雌激素具有神经保护、神经营养和促神经再生作用，应用雌激素替代治疗可使脑梗死体积明显缩小，组织病理损害的严重程度亦明显减轻，分子机制主要与激活核受体ERα与ERβ诱导的慢速基因组效应相关[11]。新近研究发现一种新型膜性雌激素受体GPR30/GPER-1，同时参与介导了雌激素快速非基因组效应及基因组效应。GPER-1与雌激素结合后被激活，活化与其相偶联的G蛋白，使Gαβγ异三聚体解离成Gα和Gβγ，快速激活细胞内的第二信号系统包括ERK1/ 2/CREB1的激活、钙离子动员等，并间接调节一系列相关基因转录，从而影响细胞的增殖、分化、存活及凋亡[12]。Jover-Mengual等[13]报道ERK1/2、CREB1在脑缺血损伤大鼠雌激素神经保护作用中扮演关键角色。本研究发现去势脑缺血雌性大鼠灌服雌二醇后，ERK/CREB通路亦被激活，且右侧海马DG区NSCs增殖增加。

目前，尚没有足够的证据表明中风病人能够从雌激素替代治疗中获益，此外，长期使用雌激素替代治疗会增加老年中风高危患者乳腺癌、子宫内膜癌等疾病的风险，因此，植物类雌激素逐渐引起了众多学者的关注。植物雌激素与哺乳动物雌激素具有相似的分子结构，能够通过结合并激活雌激素受体而发挥弱雌激素样神经保护作用，而不良反应少见[14]。补阳还五汤是治疗中风后遗症的经典名方，临床疗效较肯定，但其促神经功能恢复的机理尚未完全明确[5]。课题组前期研究证实该方能促进缺血脑内NSCs增殖，提高海马新生神经元数量，增加去势脑缺血大鼠雌二醇水平和雌二醇受体的表达，减少脑梗死体积，具有类雌激素作用[6,15]。本研究结果表明补阳还五汤能够促进去势脑缺血雌性大鼠右侧海马DG区NSCs增殖及pERK1/2、pCREB1的表达，且效果优于戊酸雌二醇，同时能被GPER-1的特异性阻断剂G15部分逆转，进一步说明本方具有类雌激素作用，而通过调控ERK/CREB通路活性是其作用的分子机制。

综上所述，补阳还五汤可以促进去势脑缺血雌性大鼠缺血侧海马DG区神经干细胞增殖，具有类雌激素作用；通过上调缺血侧海马DG区ERK1/2、CREB1的磷酸化水平,激活ERK/CREB信号通路，可能是其发挥类雌激素作用、促进内源性神经再生、修复受损的神经功能的作用机制之一。

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（本文编辑 杨 瑛）

Effects of Buyang Huanwu Decoction on Neural Stem Cells Proliferation and ERK/CREB Signaling Pathway in Hippocampus after Cerebral Ischemia in Ovariectomized Female Rats

HUANG Xin1,ZHOU Shengqiang2,LIU Shengxian1,ZHANG Bichao1,XUE Kehui1,LIU Baiyan1，2*
(1.Yiyang Medical College,Yiyang,Hunan 413000，China;2.Hunan University of Chinese Medicine, Changsha,Hunan 410208，China)

ObjectiveTo investigate the effects of Buyang Huanwu Decoction on neural stem cells(NSCs)proliferation and ERK/CREB signaling pathway in hippocampus after cerebral ischemia in ovariectomized female rats.Methods The ovariectomized female rats with cerebral ischemia model was established by the methods of ovariectomy（OVX）and middle cerebral artery occlusion(MCAO).The 36 rats were randomly divided into 6 groups,double sham-operation group,compound model group,estrogen group,estrogen+G15 group and Buyang Huanwu Decoction group and Buyang Huanwu Decoc tion+G15 group,6 rats in each group.The rats were given corresponding medicine intragastric administration for 14 days from 24 hours after operation,at the same time,BrdU and G15 were intraperitoneal injected to label the proliferation cells and block GPER-1 in each day,respectively.The NSCs proliferation of ischemic hippocampal dentate gyrus in rats was detected using immunofluorescence BrdU/nestin double staining with paraffin sections,the SP method of immunohistochemistry was used to detect the expression levelofERK1/2,CREB1phosphorylationprotein.ResultsComparedwiththecomposite model group,the number of double positive cells and pERK1/2,pCREB1 positive cells in ischemic hippocampal DG area of Buyang Huanwu Decoction group and estrogen group were increased(P＜0.05),but the indicators in Buyang Huanwu decoction group were higher than estrogen group(P＜0.05).Compared with Buyang Huanwu Decoction group,the numberof double positive cells and pERK1/2,pCREB1 positive cells in ischemic hippocampal DG area of Buyang Huanwu Decoction+G15 group were decreased(P＜0.05).ConclusionBuyang Huanwu Decoction can promote ischemic hippocampal NSCs proliferation in ovariectomized female rats after cerebral ischemia,and to activate ERK/CREB signaling pathway,which may be one of the mechanism of its estrogen-like effect and endogenous neurogenesis.

cerebral ischemia;neural stem cells;ERK/CREB signaling pathway;OVX rats;Buyang Huanwu Decoction

R285.5

A

2016-05-20

国家自然科学基金项目（81273989）；湖南省教育厅一般项目（14C1131）；湖南省科技厅一般项目（S2014F1023）；益阳市科技厅一般项目（YK1541）。

黄昕，男，硕士，主治医师，研究方向：心脑血管疾病研究。

*刘柏炎，男，博士，教授，博士研究生导师，Email:liubaiyan@126.com。