人诱导性干细胞产业前研究

张冬卉 （湖北大学，生物资源绿色转化湖北省协同创新中心，湖北 武汉 430062）

人诱导性干细胞产业前研究

张冬卉 （湖北大学，生物资源绿色转化湖北省协同创新中心，湖北 武汉 430062）

人诱导性干细胞在进入产业化之前，最主要的产业前研究方向包括以下三点．①大规模样本收集，研究特异致病突变造成的疾病表型差异，构建基因改造的人诱导性干细胞，利用分化细胞进行疾病模型研究．②高效率，功能性诱导分化获得终末分化细胞，用于细胞替代性治疗，例如：血细胞分化，胰岛细胞分化．③和基因工程，组织工程和发酵工程相结合，实现人诱导性干细胞或分化细胞的大规模制备．本文将着重分析进入真正的产业化应用之前，人诱导性干细胞研究所面临的机遇和挑战．

人诱导性多能干细胞；产业化；细胞分化；疾病模型；生物反应器

0 引言

2007年，人成纤维细胞被重编程得到人诱导性干细胞．2012年，该技术的发明者——山中伸弥获得诺贝尔生理学或医学奖．重编程技术，即利用人终末分化细胞（例如血细胞，或者成纤维细胞等）在体外经过重编程因子的处理，使之成为具有向人体各个终末细胞谱系分化潜能的“人诱导性多能干细胞”．经过体外生长因子或小分子的诱导分化，人诱导性干细胞能够分化成为其他各类型终末分化细胞．人诱导性多能干细胞的出现，为个性化定制的细胞治疗奠定了理论及实验基础．而人诱导性干细胞相关技术如何能够真正造福人类，最重要的仍然是实现从“实验室”向“生产线”的转化．本文将就人诱导性干细胞研究向产业化应用转变过程中可能遇到的重要问题进行分析．

1 大规模构建特异突变来源的人诱导性干细胞株，建立体外疾病模型

构建特异突变来源的人诱导性干细胞株是人诱导性干细胞从实验室研究向产业化过渡的基础．在研究突变⁃表型相互关系的过程中，可以解决如下问题．①进一步深化人诱导性干细胞向功能性细胞的分化，只有得到具有完整，成熟功能的终末细胞，才有可能比较突变型和正常型之间的表型差异；②和基因工程及组织工程相结合，从单细胞功能研究模式进化至组织模块功能研究模式；③构建具有功能读数的疾病模型，从而为药物筛选提供精准的临床前测试平台．

在神经领域，人诱导性多能干细胞被诱导成为运动神经元，用来建立肌萎缩性侧索硬化（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）模型［1］；分化成为多巴胺能神经元，用来建立帕金森病（Parkinson's disease，PD）模型［2］；分化成为运动神经元，建立脊髓性肌萎缩（spinal muscular atrophy，SMA）模型［3］；此外，亨廷顿病（Huntington's disease，HD）［4］，精神分裂症（Schizo⁃phrenia，SCZD）［5］，自闭症谱系障碍（autism spectrum disorder，ASD）［6］，Prader⁃Willi综合征［6］，Angelman和Prader⁃Willi综合征［7］，RETT综合征［6］也已经被患者来源的含有突变的人诱导性多能细胞体外分化产生的分化细胞进行了体外疾病模拟．在心脏领域，LQT综合症［8－10］方面，已经能够用患者来源的突变多能细胞株分化为心肌细胞，进行体外模拟．在血液及免疫领域，Fanconi贫血［11］，地中海贫血［12］，唐氏综合征［4］，I型糖尿病［4］，粘多糖贮积病I型［4］，也已经能够被体外模拟．并且，随着技术的进步，疾病表型的模拟已经越来越多地从单细胞级别模拟转变为组织模块功能模拟，从单细胞类型疾病转变为多细胞类型疾病模拟．例如：巴氏综合症［13］的疾病模拟，就是利用患者来源的突变多能干细胞分化得到心肌细胞，并在体外构建心肌组织模块，在模拟疾病的基础上利用基因编辑技术，对突变进行定点回复，取得了纠正疾病表型的效果，并在进一步寻找可能的治疗药物方面取得了积极的成果．

利用人诱导性干细胞体外分化构建疾病模型，一方面为研究疾病致病机理提供了规范、易操作、周期短的研究对象；另一方面，也为进一步探索药物或基因治疗的方案提供了体外直观的评价体系．同时，对疾病进程的精确模拟，则为体外功能性细胞的诱导分化提出了更高要求．

2 人诱导性干细胞向功能性细胞的分化

早在人诱导性干细胞出现之前，胚胎干细胞向功能性细胞的定向诱导分化就已经经历了多年研究．但是，由于胚胎干细胞获得过程中存在的伦理学问题瓶颈，使得该研究始终停留在早期研究阶段．随着重编程技术的产生，利用皮肤及血液细胞便可以产生人诱导性多能干细胞，该过程并不需要破坏胚胎，这就避免了获得人多能性干细胞过程中的伦理问题．随之而来的，则是多能性干细胞向功能性细胞分化的飞跃性发展．

目前，被广泛研究的细胞类型往往和人类重大疾病息息相关．如神经细胞，心肌细胞，胰岛细胞，血管内皮细胞，视网膜细胞等．在致力于提高分化效率和目的细胞功能性的同时，化学合成小分子对传统人工合成重组蛋白类生长因子在分化过程中的替代，进一步降低了细胞分化所需的成本．同时，各分化不同阶段细胞表面分子标志的特异性鉴定，为分化过程中的质检和目的细胞纯化创造了基础．

早在人重编程技术问世之前，麦迪逊大学的汤姆斯实验室于2001年通过体外胚胎小体凝聚的方法，利用人胚胎干细胞分化成为人的血细胞［14］．流式细胞分析结果显示，利用该方法分化得到的造血干细胞，经过进一步诱导，可以在体外分别得到人的巨噬细胞，红细胞和血小板．随后，在人重编程技术问世之后，血细胞的体外分化迅速地应用于人诱导性多能干细胞［15－16］，并在诱导分化过程中加以优化，得到高纯度的终末阶段血液细胞．血细胞分化的优势在于血细胞在体内的原生状态即为悬浮状态，该分化体系较其他分化谱系有更强的转化为大规模发酵罐式生产的潜力．由此可见，获得功能性细胞，降低分化成本，创立质检标准成为诱导性干细胞分化产业化首先需要解决的问题．

最新的研究［17］报道表明，人诱导性干细胞分化为功能型细胞并用于细胞治疗已经进入临床前期研究．其中，人诱导性干细胞分化为人视网膜色素上皮细胞，用于治疗退行性黄斑病及分化为胰岛素分泌细胞，用于治疗糖尿病，已经进入二期临床研究．与此同时，人诱导性干细胞分化为多巴胺能神经元，用于治疗PD；分化成为少突胶质细胞，用于治疗脊柱损伤；分化成为心肌细胞，用于治疗心肌梗死等也已经进入了一期临床研究．

临床前研究的进行，一方面为人诱导性干细胞在临床细胞治疗的可行性方面提供了必不可少的依据，另一方面，也为人诱导性干细胞向功能性细胞分化的工业化生产提出了要求．和小动物实验不同，可以应用于细胞治疗的功能型细胞除了在纯度上必须达到临床治疗的要求，在数量上也必须达到可移植或输入的数量级．

3 发酵工程产生工业数量级的人诱导性干细胞产品

和实验室研究不同，制备具有临床实用性的干细胞产品，除了一般提到的安全性，功能性之外，还需要细胞数量突破实验级别的壁垒．对于人诱导性干细胞而言，想要在细胞产品的数量上取得突破，向产业化转型，早期的关键在于以下几点．①从传统的平板培养方式转化为发酵罐式培养；②能够在生产的不同时期，量化生产效率及质量标准；③分类提纯并保证细胞产品储存过程中的细胞活性．

相对于造血干细胞分离提纯，人诱导性干细胞的全封闭发酵式培养还处于起步阶段．人诱导性干细胞出现不久，早在2012年就有研究进行了悬浮式培养人诱导性多能干细胞生物反应器的设计［18］．和常用的微生物反应器不同，该反应器除了保证培养细胞的活性和物料平衡外，还需要维持人诱导性多能干细胞的功能．目前，已经有人诱导性多能干细胞50 mL～1 L的生物反应器投放市场．但是对于工业化生产来讲，如何进一步地降低培养成本，将是人诱导性干细胞发酵工程下一阶段面临的重要问题．

和干细胞的维持性培养不同，分化阶段的反应器设计将会面临更多的实际问题．对于不同谱系的细胞，不同的分化阶段，均需要细化和摸索新的反应条件．和平板培养方式不同，生物反应器条件下的诱导分化，不仅仅是简单地从贴壁到悬浮，而是开启了一个全新的分化方式，同时，还要面对逐级放大过程中，每一步尝试的成本问题．目前，已经有研究建立了100 mL反应体系的从人诱导性干细胞向心肌细胞分化的生物反应器［19］，该反应器全程进行心肌细胞的悬浮分化，利用两个小分子进行诱导分化，最终得到40万细胞／mL的心肌细胞产率．这无疑是分化心肌在产业化生产上的重要一步．我们可以看到，高效率的心肌细胞体外分化条件是该设计能够实现的基础，同时，仅仅两个小分子的诱导组合，区别于重组蛋白的诱导方式，有效地为反应器分化降低了成本．

细胞产品用于生产，则生产的过程必须进行质量控制，而质量控制的前提则是有稳定的作业体系和分步的鉴定标志．要符合国际医药品稽查协约组织（Pharmaceutical Inspection Convention and Pharmaceu⁃tical Inspection Co⁃operation Scheme，PIC／S）所制定的官方主管药品优良制造规范（Good Manufacturing Practice，GMP）的标准．和以研究为基础的干细胞产品制备不同，基于法规的干细胞产品的制备必须以GMP标准为指向，做到制备过程工艺可描述化、质检标准可数字化、工程参数可控制化．基于这一点，多年来各个分化世系中，从早期的随机分化，到后来的分步分化，每一步都有对应的检测标志［20］．在检测相关细胞标志的基础上，优化分化体系，提高分化纯度，已经成为诱导性干细胞分化的基本思路．但是，这都是建立在以平板分化为基础的手工操作平台上．想要让干细胞分化产品从实验室走向工厂，所要面对的是全新的问题和挑战．这一方面，可以向蛋白质工程的蛋白产品制备进行借鉴．蛋白质工程同样是利用细胞作为反应底物，但是相对于蛋白质工程，干细胞分化产品的目的产物则为功能性细胞，对生产过程要求更高．其要求具体体现为细胞状态调整，生产过程中分化效率检测及微调，终末目标细胞组份纯化．虽然在实验室研究中已有相关突破，但真正应用于大规模的生产制备，还需要在逐级放大系统中进行验证和优化．

最后，功能细胞的保存和运输也和干细胞产品的产业化息息相关，决定了干细胞产品是不是真正地能够从生产线走向临床和应用领域．而功能型细胞的保存及功能维持，一直是细胞产品生产中的重要一环．目前应用最为广泛的无疑是脐带血的冻存，相信随着干细胞产业的兴起，会有越来越多的研究能够面向不同细胞类型，更好地解决这一问题．

4 结语

随着越来越多的人诱导性干细胞基础工作的进行，在渐渐完善实验室相关的理论研究和使用安全性的讨论之后，人诱导性干细胞的研究重点势必将逐渐过渡到应用导向的相关研究．在这一过程中，所要面对的对象从原本的生物学问题转变成为疾病人群，操作从原本的培养皿变成了反应器，这势必要求我们本着更加严谨踏实的态度，立足全局，针对细节，将人诱导性干细胞从概念性展望，转变成实实在在可以改善人类生活的细胞产品，从而服务于新一代的医疗体系．

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Study on human induced pluripotent stem cells before industrialization

ZHANG Dong⁃Hui Hubei Collaborative Innovation Center for Green Transformation of Bio⁃resources，Hubei Key Laboratory of Industrial Biotechnology，College of Life Sciences，Hubei University，Wuhan 430062，China

At present，the main industrial applications of human induced pluripotent stem cells（hIPSC） include the following three aspects：1）Large⁃scale banking of samples from different gene mutation lines．The study will focus on the genetic pathogen studied by in vitro disease modeling．2）high efficiency of obtai⁃ning functional differentiated cells for clinical purpose including cell therapy．3）Combination of genetic engineering，tissue engi⁃neering and fermentation engineering，to culture hIPSC or gener⁃ate differentiated cells in large⁃scale industrial bioreactor．This study will focus on the discussion of the opportunities and challen⁃ges of hIPSC in the industrialization before moving to the real in⁃dustrial application．

human induced pluripotent stem cells；industrializa⁃tion；cell differentiation；disease modeling；bioreactor

2095⁃6894（2017）06⁃69⁃03

R329．2

A

2016－11－05；接受日期：2016－11－22

张冬卉．博士，教授．研究方向：干细胞与组织工程．E⁃mail：15475726＠qq．com