石墨烯量子点的生物学应用

吴慧俊

石墨烯量子点的生物学应用

吴慧俊

石墨烯量子点是石墨烯家族的衍生物，石墨烯量子点除了具有石墨烯的优良性能，还具有量子限制效应和边界效应所产生的一系列新的特性，因此吸引了各领域科学家的广泛关注。 石墨烯量子点这类新颖材料的研究在这两三年内，无论是实验还是理论方面均取得了极大进展。 石墨烯量子点生物相容性好，能够光致发光，具有光电特性，可用于生物成像和生物传感器。 作者着重探索石墨烯多样的生物学应用，并从石墨烯量子点的发展、特性、制备方法、修饰、生物学应用、生物安全性等方面进行综述。

石墨烯量子点；生物学应用；量子尺寸效应；制备方法；生物安全性

石墨烯及其衍生物氧化石墨烯受到了全世界科学家越来越多的关注。石墨烯具有杰出的光电特性，生物相容性也非常优秀。 然而石墨烯是一种零能隙的半导体，它在成像及光电学方面的应用一直受到很大的限制。 为了使石墨烯获得能隙，一种零维的 衍 生 物——石 墨 烯量 子 点 (graphene quantum dots，GQDs) 应 运 而 生[1]。 GQDs 在 生 物、 医 学、 材料、新型半导体器件等领域具有重要潜在应用。 作者从 GQDs的特性、制备方法、生物学应用、生物学安全性等方面进行综述。

1 GQDs的光学特性

1.1 生物相容性好 尤其是经过各种化学修饰之后的 GQDs，可以进行特异性连接，细胞毒性低，对生物体危害小，可进行生物活体标志和检测。 GQDs对原核细胞、真核细胞及人细胞无不良影响[2]。

1.2 荧光稳定 GQDs 比有机荧光分子要稳定，可以经受反复多次激发，而不像有机荧光分子那样容易发生荧光漂白。 GQDs可以持续很长时间而不褪色，其荧光寿命可达有机染料分子的 100 倍以上，耐光漂白的稳定性也很强，可以对所标志的物体进行长时间的观察。

1.3 发射波长可控 GQDs 的发射波长可通过控制它的大小和组成的材料来调节，因而可获得多种可分辨的颜色。 不同大小的 GQDs能被单一波长的光激发而发出不同颜色的荧光，从而实现同时检测。

1.4 斯托克斯位移大 GQDs 具有较大的斯托克斯位移和狭窄对称的荧光谱峰，这样就允许同时使用不同光谱特征的量子点，而发射光谱不出现交叠，或者只有很少交叠，使标志生物分子荧光谱的区分、识别变得很容易。

1.5 激发波长范围宽 GQDs 的激发波长范围很宽，发射波长范围很窄，即可以使用小于其发射波长10 nm 的任意波长的激发光进行激发。 不同大小的GQDs可以由同一波长的光激发。

1.6 部分有上转换发光 除了有强烈的下转换的发光特性，一些 GQDs也展现了强烈的上转换发光特性。

2 GQDs的制备方法以及表征

GQDs的合成方法主要有自上而下和自下而上2种方法。自上而下的方法是指通过物理或化学方法将大尺寸的石墨烯薄片切割成小尺寸的 GQDs，包括水热法、电化学法和化学剥离碳纤维法等[3]；自下而上的方法则是指以小分子作前体通过一系列化学反应制备 GQDs。

2.1 自上而下的方法 指通过物理或化学方法将大尺寸的碳材料，比如碳纳米管、石墨烯切割成小尺寸的 GQDs。

2.1.1 水热法 水热法是制备 GQDs 中使用比较普遍且产率较高的一种方法。 Pan 等[4]以高温热处理后的氧化石墨烯片作前体，制得尺寸更小(1.5 ～5.0 nm)、结晶度更好、发绿色荧光的 GQDs。 所制备的 GQDs 荧光性质均表现出 pH 依赖性。 Xu 等[5]对优化的水热法合成了水溶性的带有锌的碳点，首先将 25 mL 0.1 mol/L 柠檬酸钠和 0.05 mol/L 氯化锌混合并倒入 50 mL 不锈钢高压釜，高压灭菌釜保持在 185 ℃ 、4 h，待冷却后用 0.22 μm 的圆柱形滤膜过滤器过滤即得带有锌的碳点。

2.1.2 物理化学法 把物理(辐射、微波等)和化学方法结合起来，把大尺度的碳材料打碎成 GQDs。Yao 等[6]认为微波热解法是制备量子点最经济绿色的方法，能快速同时制备大小均一的量子点。

2.2 自下而上的方法 与自上而下的方法相比，自下而上的方法相对较少，主要通过小分子碳的前驱物制备 GQDs，包括葡萄糖、柠檬酸等。

Tang 等[7]第 1 次报道了一种灵巧的、以葡萄糖为唯一原料的、辅以微波水热法制备 GQDs的方法。一开始葡萄糖分子脱水形成 GQDs的核心碳碳双键，提高加热温度，葡萄糖分子到达 GQDs 表面并且脱水形成新的碳碳双键，新形成的碳碳双键被有序地排列。

2.3 GQDs 的表征 以 Wang 等[8]合成的咖啡 GQDs为代表。

3 GQDs的修饰

GQDs性质稳定，有良好的发光性质，很多运用于生物医学中的诊断治疗。 所以，生物学上为了能加强 GQDs的功能，通常会对 GQDs进行化学上和物理上的修饰。

Lv 等[9]通 过 壳 聚 糖 (chitosan， CS)， 表 面 带 正电，GQDs表面带负电，依靠 H 键和静电相互作用，由 CS 包裹 GQDs。 水杨酸钠(sodium salicylate，SS)药物载入，冻干形成 GQDs-CS-SS，加强药物治疗作用，并能通过 GQDs 诊断病灶部位；CS 因质子化团聚在石墨烯的表面，产生独特的 3D 结构，加强了药物的释放作用和在体内成像的效果。

Yao 等[6]通过 pH 改变、透析碳化二亚胺[1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC)] 和 N-羟基琥珀酰亚胺(N hydroxysuccinimide，NHS) 反应等方法组成钆碳量子点(Gd carbon dots，Gd-CDs)/去 铁 铁 蛋 白 包 载 阿 霉 素 修 饰 叶 酸[apoferritin(doxorubicin)folic acid，Afn(DOX)/FA]组合物。 由于 Afn 在 pH 为 2.0 时可以分解为小单位，在 pH 为 7.4 时能够通过非共价键反应重组为笼形蛋白，利用 pH 变化将 DOX 药物包裹进入 Afn中，形成 Afn(DOX)。 然后通过微波热解法将聚乙烯亚胺和柠檬酸反应形成 Gd-CDs，其中柠檬酸提供碳原子，聚乙烯亚胺负责修饰量子点表面。 在 EDCNHS 反应环境中产生共价键反应，连接 Afn(DOX)和 Gd-CDs。 叶酸可以靶向肿瘤，通过氮气搅拌，把叶酸连接在组合物表面。

Gd-CDs/Afn(DOX)/FA 组合物加强了 DOX 药物到达癌症病灶部位的精确性，Gd-CDs 使药物具有良好的光学性质，并且能磁共振成像，材料具有良好的水溶性和载药量。

Zhu 等[10]把铁量子点和 DOX 药物包裹进入肿瘤细胞的细胞膜，新合成的材料具有体外同型肿瘤自识别和体内肿瘤自靶向功能，同时具有磁共振成像能力，提高了材料对于肿瘤治疗和诊断的精确性。这种对量子点修饰包裹的方法旨在通过变换细胞膜，达到特性靶向作用。 同时铁量子点作为核心能使用磁共振成像。

4 GQDs的生物学应用

由于 GQDs具有优良的光电特性、良好的生物相容性，所以在生物学上应用非常有价值。 在生物成像、生物传感器等领域有许多有意义的应用。

4.1 在生物成像中的应用 量子点作为生物荧光探针已被广泛应用于多种生物分析中，如细胞与组织成像及活体的研究。传统的量子点一般由一些重金属元素组成，在细胞内通过生物降解或光降解释放出重金属离子，从而产生细胞毒性[11]。 GQDs 的一系列特性，例如稳定光致发光、低生物毒性、良好溶解性和生物相容性等，使其成为极好的生物成像探针。

4.1.1 在 细胞成 像分析 中 的应 用 Zhu 等[12]取400 μg 光致发光 GQDs，加入 150 μL 培养基中与成骨肉瘤 MG-63 细胞一起培养，并没有对成骨肉瘤MG-63 细胞的存活率产生任何影响。 通过激光共聚焦显微镜观察，可发现量子点进入 MG-63 细胞并发出绿光，表明量子点能通过细胞膜进入细胞内部，GQDs在通过细胞后荧光效应不发生变化。 说明GQDs可被细胞摄取，并且发出荧光，该特性能用作细胞成像。

4.1.2 在组织成像分析中的应用 Qian 等[13]将双光子氧 化 石 墨 烯 经 聚 乙 二 醇 (polyethylene glycol，PEG)修饰后打入小鼠耳血管中进行成像，在不同的激发光下，双光子氧化石墨烯在血管中发出不同波长的荧光，较为稳定；在 6 h 之后，荧光消失一部分；15 h 后，无法看到荧光。

4.2 在生物传感器中的应用 GQDs 最大的优点和特性即能发出荧光。 由于其荧光稳点、激发波长范围宽、发射波长可控和斯托克斯位移大等特性，可以在不同激发光的作用下发出不同的光。由于这种光学特性，GQDs常用在电子通信业上。 生物学应用中将 GQDs的发光特性和信号通路的变化相偶联，例如 GQDs在电化学传感器技术方面的应用。

金属离子和 GQDs之间的相互接触会产生神奇的效果，接触之后会明显淬灭电化学发光。 由此特性，Li等[14]突发奇想，设计实验将 GQDs 和金属离子耦合，产生电化学敏感器；发现 GQDs可以被含氧集团修饰，选用了能够和金属离子络合的氮对GQDs进行修饰，通过氮将 GQDs和 Cd 金属离子结合，产生镉石墨烯量子点复合物，淬灭电化学发光，成为有效的电化学敏感剂；在探索中，还发现了关于电化学敏感剂的协调物质。其一是乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA) ，由于 EDTA对于金属的天然络合属性，EDTA 可以抢夺和 GQDs结合的金属离子，使 GQDs和金属离子分离，恢复电化学发光。 其二是半胱氨酸，可以作为掩蔽剂测定Cd，同时恢复电化学发光。 在进一步的探索下，在半胱氨酸一定量时，Cd 量越少，GQDs的发光强度越弱，Cd 和 GQDs 的发光强度呈线性关系，推断可通过镉石墨烯量子点的电化学发光敏感体系的发光强弱来测定 Cd 的浓度，即为 Cd 离子浓度传感器。

4.3 在药物输送中的应用 GQDs 可以通过化学或者物理方法连接药物，并通过化学修饰加强药物的释放效果和治疗效果，GQDs和药物的相结合将集诊断与治疗于一体，为诊疗纳米医学技术提供更多的可能性。如何将脂溶性的药物更准确输送到病灶部位是制药界的一大热点。通常运载脂溶性药物的载体为胶囊。 Jing 等[15]通过化学方法制备出诊疗智能 的胶 囊， 他 们将 二氧 化钛 (titanium dioxide，TiO2)壳、橄榄油和 GQDs 等多种物质组合起来，制备成结构独特的胶囊。 TiO2壳作为外壳，抑制紫杉醇的初期释放，控制紫杉醇在恰当的时刻释放，加强药效；橄榄油作为药物存储地；GQDs 用于荧光成像，具有诊断功能。 表明这类诊断智能的胶囊可以有效运载脂溶性药物，加强其释放和药效。

Wang 等[16]制备经 PEG 修饰的 GQDs，通过 PEG修饰后，量子点在 400 nm 的激发光下激发率增高，大约为 18.8%。 PEG 也为载药提供 H 键，使经 PEG 修饰的 GQDs 有高载药量为 2.5 mg/mg。 量子点通过PEG 修饰后性质也更为稳定。

4.4 在抗菌中的应用 GQDs 具有过氧化物酶的活性。 Sun 等[17]将 GQDs 结合低浓度过氧化氢，产生羟基自由基，既能杀死细胞，又不会损伤正常细胞，具有抗菌的药理活性，该系统具有广谱性。 通过这一性质，可以自制创可贴，用于伤口治疗。

4.5 作为光敏剂的应用 不仅具有下转换特性，还具有上转换特性。上转换特性可能是因为反斯托克斯过度，低能电子被激发成高能，在能量变化时，释放出的上转换光。 Zhuo 等[18]探索不同 TiO2和 GQDs的相互作用对亚甲基蓝的光降解效果。亚甲基蓝是光催化降解作用的测定指示剂。 若在可见光下，亚甲基蓝的光降解效率越高，则说明该材料的光催化性越强。 Zhuo 等[18]将金红石 TiO2/GQDs 和锐钛矿TiO2/GQDs 复合材料作为光催化剂，在可见光下降解亚甲基蓝。 表明 TiO2结构越简单，光催化性能越优，组合的光催化性能和 GQDs有很紧密的关联。

5 GQDs的生物安全性

GQDs是石墨烯衍生而得，因此 GQDs主要是由碳组成的纳米材料，本身就有很低的毒性。 科研人员一直在探索 GQDs的生物毒性，无论是从细胞、组织还是动物体，GQDs均保持着很低的生物毒性，为GQDs投入生物学应用的安全性提供了很充足的理论依据。

5.1 对于生物体生殖毒性的研究 GQDs 对于生物体生殖毒性的研究受到越来越多研究者的重视，如果 GQDs对生物的生殖能力造成影响，那么它的生物应用也会受到影响，无法说明 GQDs的生物安全性。 Liang 等[19]探究了石墨烯对小鼠生殖能力的损伤影响，结果发现 GQDs对小鼠的生殖能力并无很大改变，生殖能力没有变化。 说明 GQDs有很好的生物安全性。

5.2 对于生物体整体毒性的研究 GQDs 对生物体的毒性普遍较低。 Chong 等[20]将 GQDs 经尾静脉注射到小鼠体内，注射石墨烯为对照组。 苏木精-伊红染色发现，石墨烯组出现石墨烯的残留，组织切片示细胞凋亡且受损严重；GQDs组的组织切片细胞状态较为完好。 说明 GQDs对生物体组织和整体的生物毒性很低，有很好的生物安全性。

6 展望

石墨烯量子因量子限制效应和边界效应而展现出一系列新的特性，吸引了化学、物理、材料和生物等各领域科学家的广泛关注。 近两三年内，关于这种新型零维材料的研究，在实验和理论方面均取得了极大进展。

随着对 GQDs研究的一步步深入，GQDs在生物领域的应用越来越广泛，逐渐成为纳米医学中的新秀。 我们应该不断改善 GQDs的制备，优化工艺，突出其优异特点，更好地运用到生物学和医学中，为人类健康作出贡献。

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The biological applications of graphene quantum dots

WU Huijun
(School of Life Sciences and Technology，Tongji University， Shanghai 200092， China)

The graphene and its derivative graphene oxide have attracted remarkable attention of scientists due to their extraordinary optical and electronic properties and biocompatibility.Recently， the study of graphene quantum dots(GQDs)has made great progress in theory and practice. Because of strong quantum confinement， excellent edge effects and biocompatibility， GQDs are helpful for bioimaging and biosensors.In this review， the various biological application of GQDs is introduced deeply in this article.The article mainly describes in sequence of development， character，synthesis， biological application and biological toxicity of GQDs.

Graphene quantum dots(GQDs) ； Biological application； Quantum confinement； Synthesis； Biological toxicity

O59

A

2095-3097(2017)01-0047-04

10.3969/j.issn.2095-3097.2017.01.013

2016-11-06 本文编辑:徐海琴)

200092 上海，同济大学生命科学与技术学院(吴慧俊)