细胞凋亡在激素性股骨头坏死发病中作用机制的研究进展

黄立佳 孙成龙 黄杨 邹阳 王昌兴⋆

细胞凋亡在激素性股骨头坏死发病中作用机制的研究进展

黄立佳 孙成龙 黄杨 邹阳 王昌兴⋆

目前，临床上较多免疫性疾病均不能根治，使用类固醇激素延缓病情已成为一种有效手段，但长期使用激素所带来的副作用却不容忽视，如肾上腺皮质功能损害、骨质疏松和自发性骨折等。激素性股骨头缺血性坏死（Steroid-induced avascular necrosis of the femoral head，SANFH）可能由长期使用糖皮质激素引起，最新的流行病学调查显示，SANFH占所有骨坏死病例的24.1%［1］。研究表明在激素性股骨头坏死中存在成骨细胞、骨细胞、软骨细胞凋亡［2］，这表明骨细胞凋亡是SANFH病程发展中的细胞学基础。本文对目前SANFH中骨细胞凋亡的相关基因及细胞因子研究成果作一综述。

1 激素性股骨头坏死中骨细胞凋亡相关基因

1.1 Bcl-2家族 在Bcl-2家族中，Mcl-1、Bcl-w、Bcl-xL及Bcl-2具有抗凋亡及细胞保护的作用，其机制为［3］：（1）钙离子在细胞凋亡中起到重要作用，而通过实验发现高表达Bcl-2 可以抑制内质网释放钙离子，故可以起到抗凋亡的作用。（2）Bcl-2可以通过抑制自由基的产生从而抗凋亡。（3）Bcl-2在线粒体膜上定位固定凋亡蛋白前体（Apaf-1），从而使Apaf-1不能激活凋亡信号。而大剂量的激素抑制Bcl-2的表达，使凋亡信号激活且不受抑制。

相关研究表明，作为抑制和促进凋亡的Bcl家族的两种典型蛋白质，Bcl-2和Bax在调节线粒体膜通透性，线粒体功能和细胞色素C（Cyt-c）释放的作用中起关键作用，Bcl-2和Bcl-xL可以抑制线粒体通透性转换孔（PTP）开放，而避免因Bax导致PTP开放所引起的外基质内流，线粒体肿胀破坏从而细胞凋亡，Bcl-2可以阻断线粒体释放Cyt-c，细胞是否对凋亡信号发生反应较大程度上取决于Bax / Bcl-2的比值，当Bax / Bcl-2比值大于正常时，细胞易发生凋亡，当比值小于正常时，凋亡则被抑制，然而大剂量的激素抑制了Bcl-2的表达，使细胞易凋亡［4］。Zhang等［5］研究发现在激素性股骨头坏死细胞凋亡中，通过抑制 Bcl-2的减少和Bax的增加，抑制骨细胞的凋亡和股骨头坏死的恶化。有研究报道，随着SANFH病程的发展，Bcl-2的表达水平逐渐下降［6］。1.2 Fas/FasL 系统 Fas/FasL系统是细胞凋亡的主要途径之一，Fas（也称为CD95或APO-1或TNFRSF6）是 I 型跨膜糖蛋白，在其细胞质区域含有死亡结构域（DD），这对于凋亡的诱导是必需的。Fas 的配体 FasL，为Ⅱ型跨膜糖蛋白，主要在活化 T 细胞膜上表达。Fas 和FasL属于TNF家族成员，凋亡的诱导由Fas与其配体FasL的相互作用触发，FasL是允许衔接蛋白Fas相关死亡结构域（FADD）募集和procaspase-8结合的 40kDa膜蛋白［7］，Fas 和 FasL结合形成一种活性形式三聚体，传递凋亡信息，诱导凋亡进行［8］。Thaler等［9］报道称，使用萝卜硫烷上调小鼠骨细胞内Fas的表达，并诱导前成骨细胞的凋亡。Martin 等［10］通过研究发现 MLO-Y4 骨细胞用地塞米松处理后出现 FasmRNA 表达增加，并导致骨细胞凋亡。

1.3 p53基因 P53与细胞凋亡密切相关，p53通过控制增殖细胞由细胞周期G1向S移行的控制点参与细胞周期调控。其具有强迫DNA损伤的细胞停滞在G1期并进行DNA修复。如DNA不能被修复，则诱导其凋亡。p53已被证明能导致线粒体功能障碍，且能通过多种信号通路激活caspase家族，诱导细胞的凋亡［11］。Ou等［12］研究发现FAK-P53-MDM2信号回路在肿瘤细胞增殖和凋亡中起重要作用，FAK和MDM2是肿瘤基因，FAK是p53的负调节物，通过敲除FAK和MDM2基因，p53基因得到活化，促进了肿瘤细胞凋亡及抗增殖效应。Okuma等［13］在缺血/再灌注诱导的特发性骨坏死模型中，观察到p53的过表达诱导MLO-A5前成骨细胞的凋亡，且利用p53抑制剂改善这种情况。Sui等［14］在大剂量糖皮质激素诱导的骨质疏松模型中应用流式细胞仪检测到与对照组比较BMSC凋亡增加，且p53表达增加。

1.4 Caspase家族 有研究表明Caspase与真核细胞的凋亡密切相关，目前已经发现总共14个家族成员，且可以分为两类：一个涉及其他Caspase家族成员的激活，包括Caspase- 1，2，4，5，8，9和10；另一种是主要介导凋亡的执行期，包括Caspase-3，6，7，14。其中Caspase-3是Caspase家族中发挥作用的主要形式，是凋亡级联反应的中心环节，是关键酶和凋亡的执行者［15］。凋亡由线粒体外膜的完整性丧失，细胞凋亡蛋白如Cyt-C的释放，然后激活Caspase-3，通过Fas / FasL或Bax / Bcl-2途径诱导的细胞凋亡［16］。贾岩波等［17］发现在激素性股骨头坏死早期细胞凋亡中，Caspase-3表达显著增高，且可通过药物抑制Caspase-3的表达而减少骨细胞的凋亡。这表明Caspase-3与激素性股骨头坏死早期细胞凋亡密切相关。Xu等［18］2014年报道在激素性股骨头坏死中，STAT1-Caspase-3通路在激素性股骨头坏死中起到重要作用，Caspase-3的上调是导致细胞凋亡的主要因素。

1.5 血红素氧合酶-1 近期研究表明，血红素氧合酶-1（heme oxygenases HO-1）具有抗氧化、抗凋亡及在缺血缺氧情况下保护细胞的功能［19］。作为细胞保护酶，HO-1催化血红素降解中的限速步骤，并产生三种最终副产物，包括胆红素、CO及铁离子。胆红素是由胆绿素和胆绿素还原酶反应产生，是消除脂质过氧化物有效的自由基清除剂，CO可以减弱一些氧合酶的催化活性，并抑制过量的NO产生［20］。李杰等［21］利用质粒将HO-1转染进入成骨细胞中，乙醇干预24h后流式细胞仪检测细胞凋亡，结果显示HO-1转染组细胞凋亡率明显减低，这表明转染HO-1能抑制乙醇诱导的细胞凋亡。Sato等［22］发现在缺血性股骨头坏死疾病进展中存在细胞凋亡，且与HO-1mRNA表达有存在相关性，在创伤后3h在成骨细胞和骨细胞中检出凋亡相关基因HO-1mRNA的表达，在6h时出现组织学改变，表现为骨骺处活跃成骨细胞的死亡，TUNEL染色阳性细胞表达，24h时在骨细胞和骨髓细胞中观察到凋亡小体，在3～24h内HO-1mRNA持续表达，在24h后HO-1mRNA表达逐渐减少或消失。但目前国内外尚未报道HO-1是否参与激素性股骨头坏死细胞凋亡进程，有待后续研究。

2 激素性股骨头坏死中骨细胞凋亡相关细胞因子

2.1 低氧诱导因子1α 低氧诱导因子1α（hypoxia －inducible factor-1 alpha，HIF-1α）在细胞缺血缺氧时产生保护作用，在正常氧含量情况下，HIF-1α活性受到氧依赖性羟化酶－缺氧诱导因子抑制因子（factor inhibiting HIF，FIH）及脯氨酰羟化酶（prolyl－hydroxy-lases，PHDs）的一系列调控，从而羟基化被抑制，细胞缺氧时，FIH和PHDs的活性受到抑制，HIF-1α的活性增高，缺氧时可诱导HIF -1α进入细胞核，与HIF - 1β结合形成HIF - 1，提高共激活因子CBP/ P300，反式激活下游靶基因，包括纤溶酶原激活物抑制剂1型，血管内皮细胞生长因子及fm-样酪氨酸激酶1等，导致细胞一系列功能改变，如血管发生，能量代谢等，使其对缺氧环境产生耐受［23］。He等［24］报道HIF - 1α在缺氧时可通过多种信号通路来实现对细胞在低氧状态下的保护。

缺血缺氧是激素性股骨头坏死发病的关键因素，赵振群等［25］研究发现HIF-1α在激素性股骨头缺血坏死早期呈现低表达，且与骨细胞凋亡率呈负相关。Fan等［26］在激素性股骨头坏死动物模型中使用PHDs抑制剂EDHB抑了HIF-1α的降解，激活HIF-1信号通路促进血管生成，降低空骨陷窝率，减少细胞凋亡。至今，对于激素如何抑制HIF-1α的表达国内外尚未报道，未来可作进一步的研究。

2.2 血管内皮生长因子 血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）是一种同源二聚体糖蛋白，活化的VEGF能促进新血管的生成，红细胞生成及细胞的增殖和生存，而VEGF-165不仅在VEGF家族中活性最高，且分布范围之广，是发挥作用的主要形式，有研究通过建立急性放射性皮肤损伤模型，分组给予不同血管生长因子，通过观察微循环和细胞凋亡的变化比较发现VEGF-165在抑制细胞凋亡和预防损伤进展上比其他因子更有效［27］。研究发现，VEGF参与缺血性股骨头坏死的病理生理过程，Zhang等［28］将6周龄Sprague Dawley大鼠股骨颈周围血管切除制造缺血性股骨头坏死模型，通过实时RT-PCR研究分析软骨细胞中VEGF的表达，结果显示，在24h内，常氧条件下软骨细胞中的VEGF水平显著高于缺氧条件下的含量；72h后，缺氧条件下的软骨细胞中的VEGF水平增加并且显著高于常氧条件下的含量。Wu等［29］应用桃红四物汤促进激素性股骨头坏死模型体内VEGF的表达，并且明显抑制了成骨细胞和软骨细胞的凋亡。Hang等［30］应用脂质体将VEGF-165导入骨髓间充质干细胞中，将自体VEGF-165转基因骨髓间充质干细胞植入早期股骨头坏死模型，12周后观察到转基因组的骨小梁的规则布置和明显的骨再生，且新生毛细血管数量与非转基因自体骨髓间充质干细胞植入组比较明显增加，证明VEGF-165能改善早期股骨头坏死模型中的骨重建和血管再生，为治疗早期股骨头坏死提供一种好方法。

3 讨论

类固醇激素诱发的股骨头无血管性坏死主要好发于年轻人和老年人，患者一般曾长期或短期密集使用激素，在多数患者中，该疾病是双侧的，且病变面积很广、致残率高。目前，激素性股骨头坏死主要通过手术来治疗，包括：髓芯减压术、植骨术、股骨近端截骨术及人工股骨头置换术。

细胞凋亡是激素性股骨头坏死的重要病因之一，激素在病程进展中，诱导了成骨细胞和骨细胞的凋亡，减少破骨细胞的形成，导致骨转换的减少，促进连续凋亡。目前通过干预相关重要基因及细胞因子从而减少骨细胞凋亡率已成为研究的热点，但对于激素如何上调或下调凋亡基因及细胞因子还需做进一步的探究，明确激素诱导细胞凋亡的机制，从而可选择激素致病的最初靶点进行干预，从源头降低应用激素治疗相关疾病时股骨头坏死的风险，最大程度的保证激素的疗效。

［1］ Cui L, Zhuang Q, Lin J, et al. Multicentric epidemiologic study on six thousand three hundred and ninety five cases of femoral head osteonecrosis in China. Int Orthop, 2016,40(2)：267-276.

［2］ Zhao Z Q, Bai R, Liu W L, et al. Roles of oxidative DNA damage of bone marrow hematopoietic cells in steroid-induced avascular necrosis of femoral head. Genet Mol Res, 2016,15(1). doi： 10.4238/gmr.15017706.

［3］ 张华峰,徐倩.细胞凋亡在激素性股骨头坏死中作用机制的研究进展.中华老年骨科与康复电子杂志,2016,2(2)：119-124.

［4］ Zhang L, Yuan X, Wang S, et al. The relationship between mitochondrial fusion/fission and apoptosis in the process of adipose-derived stromal cells differentiation into astrocytes.Neurosci Lett, 2014,575：19-24.

［5］ Zhang M, Hu X.Mechanism of chlorogenic acid treatment on femoral head necrosis and its protection of osteoblasts.Biomed Rep.2016,5(1)：57-62.

［6］ Zhang, C., et al., Apoptosis associated with Wnt/beta-catenin pathway leads to steroid-induced avascular necrosis of femoral head. BMC Musculoskelet Disord, 2015. 16： p. 132.

［7］ Volpe E, Sambucci M, Battistini L, et al. Fas-Fas Ligand：Checkpoint of T Cell Functions in Multiple Sclerosis. Front Immunol, 2016,7：382.

［8］ Russo S, Sadile F, Esposito R, et al. Italian experience on use of E.S.W. therapy for avascular necrosis of femoral head. Int J Surg,2015,24(Pt B)：188-190.

［9］ Thaler R, Maurizi A, Roschger P, et al. Anabolic and Antiresorptive Modulation of Bone Homeostasis by the Epigenetic Modulator Sulforaphane, a Naturally Occurring Isothiocyanate. J Biol Chem,2016,291(13)：6754-6771.

［10］ Martin D A, Siegel R M, Zheng L, et al. Membrane oligomerization and cleavage activates the caspase-8 (FLICE/MACHalpha1) death signal. J Biol Chem, 1998,273(8)：4345-4349.

［11］ Yang S H, Wang S M, Syu J P, et al. Andrographolide induces apoptosis of C6 glioma cells via the ERK-p53-caspase 7-PARP pathway. Biomed Res Int, 2014,2014：312847.

［12］ Ou W B, Lu M, Eilers G, et al. Co-targeting of FAK and MDM2 triggers additive anti-proliferative effects in mesothelioma via a coordinated reactivation of p53. Br J Cancer, 2016,115(10)：1253-1263.

［13］ Okuma C, Kaketa T, Hikita A, et al. Potential involvement of p53 in ischemia/reperfusion-induced osteonecrosis. J Bone Miner Metab, 2008,26(6)：576-585.

［14］ Sui B, Hu C, Liao L, et al. Mesenchymal progenitors in osteopenias of diverse pathologies： differential characteristics in the common shift from osteoblastogenesis to adipogenesis. Sci Rep,2016,6：30186.

［15］ Cheng B, Zhang Y, Wang A, et al. Vitamin C Attenuates Isoflurane-Induced Caspase-3 Activation and Cognitive Impairment. Mol Neurobiol, 2015,52(3)：1580-1589.

［16］ Zawada W M, Mrak R E, Biedermann J, et al. Loss of angiotensin II receptor expression in dopamine neurons in Parkinson's disease correlates with pathological progression and is accompanied by increases in Nox4- and 8-OH guanosine-related nucleic acid oxidation and caspase-3 activation. Acta Neuropathol Commun,2015,3：9.

［17］ 贾岩波,刘万林,任逸众等.维生素E干预激素性股骨头坏死早期细胞凋亡的研究.中华实验外科杂志,2014,31(2)：375-377.

［18］ Xu X, Wen H, Hu Y, et al. STAT1-caspase 3 pathway in the apoptotic process associated with steroid-induced necrosis of the femoral head. J Mol Histol, 2014, 45(4)： 473-485.

［19］ Zou W, Yang S, Zhang T, et al. Hypoxia enhances glucocorticoidinduced apoptosis and cell cycle arrest via the PI3K/Akt signaling pathway in osteoblastic cells. J Bone Miner Metab, 2015, 33(6)：615-624.

［20］ Chai J, Luo L, Hou F, et al. Agmatine Reduces Lipopolysaccharide-Mediated Oxidant Response via Activating PI3K/Akt Pathway and Up-Regulating Nrf2 and HO-1 Expression in Macrophages.PLoS One, 2016,11(9)：e163634.

［21］ 李杰,张丰泉,杜振宁等.转染血红素加氧酶-1能抑制乙醇诱导的成骨细胞凋亡.中华实验外科杂志,2015,32(4)：847-849.

［22］ Sato M, Sugano N, Ohzono K, et al. Apoptosis and expression of stress protein (ORP-150,HO-1)during development of ischaemic osteonecrosis in the rat. J Bone and joint Surg(Br).2001,83-B(5)： 751-759.

［23］ Hong J M, Kim T H, Chae S C, et al. Association study of hypoxia inducible factor 1alpha (HIF1alpha) with osteonecrosis of femoral head in a Korean population. Osteoarthritis Cartilage,2007,15(6)：688-694.

［24］ He L, Xu J, Chen L, et al. Apelin/APJ signaling in hypoxiarelated diseases. Clin Chim Acta, 2015,451(Pt B)：191-198.

［25］ 赵振群,张志峰,刘万林等.激素性股骨头坏死过程中低氧诱导因子1α与骨细胞凋亡.中国组织工程研究,2015,19(51)：8201-8207.

［26］ Fan L, Li J, Yu Z, et al. Hypoxia-inducible factor prolyl hydroxylase inhibitor prevents steroid-associated osteonecrosis of the femoral head in rabbits by promoting angiogenesis and inhibiting apoptosis. PLoS One, 2014,9(9)：e107774.

［27］ Yu D, Li S, Wang S, et al. Development and Characterization of VEGF165-Chitosan Nanoparticles for the Treatment of Radiation Induced Skin Injury in Rats. Mar Drugs, 2016,14(10).DOI：10.3390/md14100182.

［28］ Zhang W, Yuan Z, Pei X, et al. In vivo and in vitro characteristic of HIF-1alpha and relative genes in ischemic femoral head necrosis. Int J Clin Exp Pathol, 2015,8(6)：7210-7216.

［29］ Wu J, Yao L, Wang B, et al. Tao-Hong-Si-Wu Decoction ameliorates steroid-induced avascular necrosis of the femoral head by regulating the HIF-1alpha pathway and cell apoptosis. Biosci Trends, 2016,10(5)：410-417.

［30］ Hang D, Wang Q, Guo C, et al. Treatment of osteonecrosis of the femoral head with VEGF165 transgenic bone marrow mesenchymal stem cells in mongrel dogs. Cells Tissues Organs,2012, 195(6)：495-506.

310053浙江中医药大学第二临床医学院（黄立佳 孙成龙 黄杨）

310005 浙江中医药大学附属第二医院（邹阳 王昌兴）

*通信作者