脑胶质瘤小鼠模型构建研究进展

张祖勇 程洪强 董晓巧 王昊 张仕蓉

脑胶质瘤小鼠模型构建研究进展

张祖勇 程洪强 董晓巧 王昊 张仕蓉

脑胶质瘤（glioma）是一种常见的脑肿瘤，根据细胞形态等组织学特征，可以分成Ⅳ级，其中Ⅰ、Ⅱ级为进展慢，恶性程度低的低级别胶质瘤；而Ⅲ、Ⅳ级为恶性程度高的高级别肿瘤，包括最常见的多形性胶质母细胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）。胶质母细胞瘤恶性程度高，患者生存时间短，1年生存率＜50%，5年生存率＜5%［1］。世界卫生组织建议根据基因突变的分子病理特征对胶质瘤进行分型，指导患者的管理和药物使用［2-4］。目前对胶质瘤的治疗方法主要是手术切除，辅助以术后放化疗。由于胶质瘤的高度侵袭性无法完全去除肿瘤细胞。血脑屏障的存在降低化疗药物治疗效果，胶质瘤患者术后易复发［1］。对胶质瘤发生的分子与细胞水平的认识及新型治疗药物的研发均需要模式生物［5］。本文对胶质瘤研究中的小鼠模型进行综述。

1 化学诱变

上世纪70年代用致癌剂诱导动物产生弥漫性胶质瘤是早期广泛使用的胶质瘤动物模型。孕鼠尾静脉注射亚硝基硫脲（N-ethyl-N-Nitrosourea，NEU）导致多数宫内暴露致癌剂仔鼠发生胶质瘤（成年动物注射致癌剂不能产生脑瘤）［6］。对化学诱变产生的胶质瘤进行基因变异分析，发现存在与临床一致的p53突变和PDGFR/EGFR基因拷贝数增加等基因变异［7］。化学诱导产生的胶质瘤较好模拟了临床上胶质瘤的遗传异质性，同时保全小鼠的免疫系统和血脑屏障。然而由于基因突变的随机性导致胶质瘤生成重复性差（如肿瘤发生率，恶性程度，肿瘤类型与位置等）不足，现已较少使用这种小鼠模型研究胶质瘤。

现在普遍使用的胶质瘤细胞株，如9L，C6，GL261及CNS-1等，来自化学诱导的大鼠或小鼠胶质瘤模型［8］。C6细胞株来自甲基硫脲处理的大鼠，组化与肿瘤标志物与人胶质母细胞瘤相似，但无抑癌基因p53的变异。CNS-1同样是大鼠胶质瘤细胞株，表达胶质瘤标志物，比如GFAP，S100β等，及表现出人胶质瘤的典型特征弥漫性和浸润性生长。9L和GL261来自小鼠的胶质瘤细胞株，前者有p53突变和EGFR过表达，但不表达GFAP，也不表现为弥漫性侵入式生长，因此认为其为胶质肉瘤。GL261表现为低分化的胶质母细胞瘤。具有p53和K-ras 基因突变及PI3K/AKT活化等特征。这些细胞株不仅普遍应用于胶质瘤的分子细胞生物学研究，也是异种细胞移植模型中普遍使用的细胞来源。

2 异种细胞移植

将肿瘤细胞注射入小鼠皮下（异位）或颅腔内（原位）可以形成异位或原位胶质瘤［9］。肿瘤细胞可以是来自化学诱变的胶质瘤动物的肿瘤细胞系，也可以是胶质瘤患者来源的肿瘤细胞。皮下异位移植操作简单，重复性好，易观察肿瘤生长的动态过程，适合研究肿瘤细胞的增殖行为。异位细胞移植失去脑部的环境特征，限制其在药物研发中的作用，尤其是针对肿瘤微环境的药物研发。原位胶质瘤细胞移植模型能较好的规避肿瘤微环境问题。异种移植的另外一个缺陷是使用免疫缺陷的小鼠，阻碍对肿瘤与免疫系统相互作用的研究。人源化小鼠的研发与使用可以让异种细胞移植模型更好的服务于肿瘤的基础与药物开发研究。该小鼠模型在胶质瘤基础研究中广泛使用，检测或筛选新的基因或信号通路在胶质瘤发生发展中的作用［10-11］。

3 转基因小鼠模型

小鼠与人在遗传与生理上存在多方面相似性，这是小鼠成为主要模式动物的原因。随着技术的进步，现在可以在分子水平操作小鼠的基因组，包括不可传代的体细胞转染和可传代的稳定遗传修饰。研究发现RTK/PI3K、p53和Rb信号异常是胶质瘤发生与恶性进展的核心通路，因此胶质瘤小鼠模型主要是回绕这些核心通路构建的。

3.1 IDH1R132H突变条件性敲入小鼠模型 异柠檬酸脱氢酶IDH是三羧酸循环中一个关键限速酶，包括IDH1、IDH2和IDH3三个亚型，催化异柠檬酸氧化脱羧生成α-酮戊二酸。人胶质瘤中存在IDH1突变，主要是R132H突变，与患者预后相关［2，3，12］。在星形细胞瘤、少突胶质瘤和继发胶质母细胞瘤中，＞90%患者存在IDH1突变。与之相反，在原发胶质母细胞瘤中，较少发生IDH1突变，表明IDH1突变在胶质瘤的发生中发挥关键作用。突变的IDH1获得新的催化能力，将α-酮戊二酸进一步转化成2-羟基戊二酸（2-HG）。代谢物2-HG可以抑制α-酮戊二酸依赖的与表观遗传有关的酶类（如 TET2，DNMT1），导致基因组 DNA 高度甲基化［13］。还可以通过抑制JAK活化，抑制细胞凋亡，促进肿瘤发生

［14］。最近的一项研究应用Cre-loxP系统构建了条件性IDH1突变（IDH1R132H）敲入小鼠模型［15］。在小鼠IDH1基因的外显子3上引入R132H突变，并在外显子2与3间的内含子中插入包括loxP位点的IDH1小基因（mini-gene，包括野生型外显子3～9序列，3'非翻译区和polyA信号）。条件性突变敲入小鼠与Nes-CreERT2小鼠（Nestin基因启动子驱动Cre重组酶在神经干/前体细胞特异表达，CreERT2为Cre的修饰形式，在他莫昔芬作用下发挥重组酶活性）杂交产生的后代成年后用他莫昔芬诱导可以在神经干/前体细胞中表达突变的IDH1。分析发现该小鼠发生与胶质瘤早期相似的病变［15］。表现为小鼠SVZ神经干/前体细胞数目增加，SVZ细胞侵袭并发生异位增殖形成胶质瘤前体灶。尤为重要的是，Wnt信号、端粒酶信号、细胞周期等活性增强及基因组DNA甲基化水平上升，且基因表达谱也与人胶质瘤相近。IDH1突变敲入小鼠模型有力支持了IDH1突变在胶质瘤发生早期的关键作用。IDH1突变敲入小鼠的表型为神经干细胞的不可控增殖，与临床上胶质瘤还是存在一定的差异，因此该小鼠模型适合于研究胶质瘤的发生与细胞起源，而不适合于胶质瘤的治疗药物筛选。人胶质瘤中，IDH1突变与P53突变共同发生，因此该小鼠组合p53基因敲除能否发生与人胶质瘤病理更加接近的小鼠胶质瘤值得进一步研究。

3.2 p53/Nf1条件性双敲除小鼠模型 p53是一个抑癌基因，在多数的肿瘤包括胶质瘤中存在p53基因突变。Nf1（Neurofibromatosis type 1）也是一个抑癌基因，负向调控Ras信号，因此Nf1缺失导致Ras信号活化［16］。在小鼠中，仅敲除p53基因不能够产生胶质瘤［17］。GFAP-Cre（Glial fibrillary acidic protein，在星形胶质细胞特异表达Cre，）介导的p53/Nf1双基因条件性敲除小鼠发生典型的胶质瘤，存在伪栅栏样（pseudopalisading）肿瘤细胞、坏死、小血管增生等典型特征［17］。该小鼠模型表明双抑癌基因缺失足够诱导小鼠产生胶质瘤，并存在低级别胶质瘤向高级别胶质瘤恶性进展现象。与此类似的，GFAP-Cre介导的p53与另一抑癌基因PTEN组合缺失小鼠也发生胶质母细胞瘤［18］。抑癌基因双缺失小鼠胶质瘤模型是研究胶质瘤发生中肿瘤细胞起源问题的工具［19-20］，同时也可以用于胶质瘤靶向药物的研发。虽然p53与Nf1双突变能够诱导小鼠产生类似人胶质瘤病变，但在Nf1突变在人胶质瘤中不常见，PDGFR或EGFR拷贝数增加引起Ras信号异常活化。

3.3 PDGF限制性过表达小鼠模型 PDGF/PDGFR信号属于RTK信号，通过活化下游的PI3K/AKT和Ras/MAPK促进肿瘤细胞增殖和抗凋亡能力。PDGF阻止胶质前体细胞的分化，促进其自我更新。高级别胶质母细胞瘤中存在PDGFR基因拷贝数增加的现象，表明PDGF/PDGFR信号在胶质瘤的发生发展中发挥重要的作用。在GFAP或Nestin阳性的神经干细胞中通过病毒介导过表达PDGF可以诱导小鼠产生胶质瘤，大部分为低级别少突胶质瘤。这一小鼠模型表明小鼠胶质细胞或神经干细胞中自分泌过量PDGF足以诱导小鼠神经前体细胞产生肿瘤［21］。PDGF过表达加上抑癌基因INK4a-ARF敲除能够诱导小鼠产生高级别胶质瘤。INK4a-ARF基因通过mRNA剪接编码两个功能不同蛋白，分别是细胞周期抑制分子p16INK4a和p19ARF［22］。INK4a-ARF基因敲除小鼠自发产生多种肿瘤［23］。INK4a-ARF基因敲除还可以与EGFR活化突变过表达组合产生胶质瘤样病变［24］。INK4a-ARF基因敲除小鼠组合PDGF过表达胶质瘤小鼠模型用于筛选蛋白酪氨酸激酶抑制剂，发现CSF-1R阻断增加胶质瘤对RTK抑制剂的敏感性［25］。

PDGFB过表达是通过RCAS/tv-a系统实现的。RCAS病毒载体是鸟逆转录病毒（avian sarcoma-leukosis virus-A，ASLV-A）RCAS/tv-a系统衍生载体，限制性感染带有tv-a受体的鸟类细胞［26］。哺乳动物细胞转染表达tv-a受体，或通过转基因方法在小鼠特异细胞或组织中表达tv-a受体，能够实现RCAS载体携带的基因在特异细胞或组织中过表达。如在小鼠中，通过GFAP或Nestin基因的启动子在胶质细胞或者神经干细胞中特异表达tv-a受体的转基因小鼠Gtv-a或Ntv-a，感染带有EGFR或PDGFB的RCAS载体能够在胶质细胞或神经干细胞中特异过表达EGFR或PDGFB。同样，通过RCAS载体表达干扰RNA，也能够实现在小鼠特定表达t-va受体的细胞中敲降目的基因的表达。该系统在其它肿瘤的研究中也有应用［27-28］。

3.4 其它小鼠 GFAP基因启动子驱动的癌基因在小鼠胶质细胞中高表达也可以诱导小鼠产生胶质瘤，比如GFAP-vsrc转基因小鼠中，GFAP启动子驱动Rous肉瘤病毒v-Src在小鼠胶质细胞特异表达，可以使小部分小鼠产生胶质瘤［29］。同样GFAP基因启动子驱动的V-Ha-RAS转基因小鼠可以产生星形细胞瘤［30］。Src和Ras活化虽然能够诱导小鼠产生胶质瘤样病变，但临床上，Src和Ras基因突变并不常见，因此这两种胶质瘤小鼠模型目前已经较少使用。

除RCAS/tv-a系统改变小鼠神经细胞基因的方法外，最近也有研究把最新的基因编辑技术CRISPR/Cas9引入小鼠胶质瘤中［31-32］，简单快速的在小鼠神经细胞中敲除一个或多个抑癌基因。CRISPR/Cas9也可以应用于转基因小鼠的制备，取代之前广泛使用的胚胎干细胞中基因重组的方法。

4 展望

随着新技术在临床研究中的应用，目前对胶质瘤的分子病理已经有较系统的认识，世界卫生组织也建议在分子基础上对胶质瘤进行分型管理和治疗。动物水平的研究可以较好的验证这些基因变异在肿瘤发生与恶性进展中的确切作用，补充了临床研究。目前胶质瘤基础研究多集中在成人胶质瘤方向，而儿童胶质瘤是儿童的主要肿瘤，与成人胶质瘤有不同的基因突变和组化特征。儿童胶质瘤的理解与治疗的改善需要与之对应的动物模型的发展。

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浙江省科技厅公益基金项目（2015C37114）

31007 杭州市中医院（张祖勇）

31005浙江大学医学院病理与病理生理学系（程洪强）

310006 杭州市第一人民医院（董晓巧 王昊 张仕蓉）