甲基丙烯酰胺基明胶水凝胶在关节软骨损伤修复领域中的研究进展

张传昕 李梁 吴海山

甲基丙烯酰胺基明胶水凝胶在关节软骨损伤修复领域中的研究进展

张传昕 李梁 吴海山

组织工程；软骨，关节；细胞培养技术；水凝胶类；损伤，软骨；甲基丙烯酰胺基明胶水凝胶

关节软骨是一种无血管、神经和淋巴腺的组织，其含有的软骨细胞数量少且缺乏干细胞[1-2]，因此关节软骨损伤后的自我修复能力有限。在接受关节镜术的患者中，60% 存在软骨损伤[3-4]。而软骨损伤后，大多数都会进展为骨关节炎[2]。目前临床上针对软骨损伤的处理方案有以微骨折法为代表的促进修复手术和以自体软骨移植或同种异体软骨移植为代表的软骨修复手术，但存在纤维软骨修复、供体不足、手术过程复杂、免疫排异等问题，且其远期疗效欠佳[5-8]。

现有技术的缺陷使研究者转向近年来飞速发展的组织工程和再生医学领域。20年前，Langer 和 Vacanti[9]制订了组织工程三个基本原则，即分离的细胞或细胞替代物，诱导组织生发的物质以及容纳细胞的基质。除种子细胞和细胞因子外，支架的性能对软骨修复有至关重要的影响。现有多种结构的支架用于软骨修复的研究和应用，如纤维支架、水凝胶和微载体纳米支架。其中，水凝胶因其具有良好的生物组织相容性、生物降解性和细胞黏附性而受到关注[10-12]。此外，水凝胶还具有下述特点[11-14]：( 1) 含水量高，与软骨细胞外基质高度相似，有利于营养运输和细胞代谢；( 2) 可调控的机械强度，通过对水凝胶的修饰控制其压缩模量和弹性模量；( 3) 构建细胞 3D 培养体系，3D 环境可使细胞呈圆形或卵圆形，维持软骨细胞正常表型[15-17]；( 4) 可实现液－固相转换，通过物理或化学方式的催化诱导而改变状态。在众多结构的水凝胶中，甲基丙烯酰胺基明胶水凝胶 ( gelatin methacryloyl hydrogels，GelMA ) 除了具有上述特点外，其易操作、低成本、安全无毒以及广泛的临床应用[18]而受到关注。通过化学或物理交联、光聚合或者精细制造技术[14,19-20]，可以改善水凝胶的物化特性和生物行为。现将 GelMA 的特性及其在软骨修复领域的研究进展概述如下。

一、明胶水凝胶的特性

明胶是一种主要由 I 型胶原变性水解而来的蛋白质产物[21]，故具有良好的生物降解性和组织相容性，且因成本低廉、易获得、降解后无毒性[10]被广泛应用于医药、食品领域，如临床中的血浆代用品以及疫苗等蛋白制剂的稳定剂[22]。与胶原蛋白不同的是，明胶的抗原性由于加热变性而显著降低，所以不易引起机体的免疫应答。但其保留了胶原蛋白的细胞黏附特性和基质金属蛋白酶附着位点[23]。因此，明胶基质可以促进细胞的迁移、增殖和分化以及引发细胞介导的酶促降解作用[24]。

为使明胶基水凝胶在体内保持稳定，预先在其侧基修饰官能团，随后可利用多种方式将明胶共价交联成网状结构，但只有少数几种适合同步交联和细胞封装[25]，如光交联和酶促交联。与酶促反应相反，光引发能在时间和空间上控制交联过程，这对制备结构复杂的水凝胶至关重要[26]。紫外线和可见光都可以引发光交联，目前使用最多的为紫外线光敏型明胶。

有多种光引发剂能够引发光交联，多数文献报道应用光引发剂 Irgacure 2959配合 GelMA 来启动交联反应。Irgacure 2959属于裂解型光引发剂，细胞毒性比其它光引发剂低，可在紫外光照条件下可以裂解出能够打开烯类 π键的自由基[27]。紫外光波长的大小对于光照交联反应的进行十分关键，波长 300nm 的紫外光能量约为 400kJ / mol，与键能 120～840kJ / mol 相当，大于一般化学反应的活化能，这是光能引发聚合的依据。各类烯类单体都有各自特殊的吸收光区域，一般为波长 200～300nm 的紫外光区。但对于光交联水凝胶反应中紫外线波长的确定，各文献的结果并不一致[28-29]，还需进一步实验加以论证。

Bartnikowski 等[30]研究光引发剂浓度和紫外线剂量是否对软骨细胞有毒性作用，其认为引发剂的浓度需要根据活性基团的数量而定，且不同紫外线剂量对细胞无显著毒性作用。然而，紫外线对生物体的损伤作用是众所周知的，尽管细胞活性在短期内未受影响，但紫外线损伤依然可能对细胞功能和组织形成存在潜在的长期副作用[31]。其次，光引发剂 Irgacure 2959对细胞的长期作用也未研究透彻。所以，对可见光交联及相应引发剂的研究是有价值且必要的。

二、GelMA 的特性

为使明胶基水凝胶性质进一步优化，可修饰不同类型的官能团，如甲基丙烯酸酐等。Van den Bulcke 等[32]在2000年首论述了 GelMA，因其固有的生物活性和可调控的生化性质而受到组织工程领域的青睐[33]。GelMA 由甲基丙烯酸酐在弱碱性环境 ( pH＝7.5) 中修饰明胶分子链上的氨基得到，在 50℃ 的反应温度下，氨基酸的氨基与酰氯或酸酐在弱碱溶液中发生作用时，氨基即被酰基化，以此交联到明胶分子链上。

在设计 GelMA 时，充分考虑其理化特性 ( 如硬度、降解曲线、孔径大小 ) 和细胞行为 ( 如细胞活性、增殖、分化和迁移 ) 是决定其应用于不同组织工程领域的关键，如改变 GelMA 的修饰度或光交联的条件。调节甲基丙烯酸酐修饰明胶的浓度，可改变其生化特性，称为 GelMA 的修饰度[32]。如骨髓间充质干细胞的高密度培养有利于细胞向软骨细胞分化[34]，当 GelMA 的修饰度接近 80% 时，凝胶内大分子广泛的交联可以阻碍细胞的扩散，以此促进间充质干细胞向软骨细胞的分化。修饰度在 20%～80% 的GelMA 可以保持稳定的理化性质，且随着修饰度的增高，凝胶硬度和耐久度随之增高而孔径则减小[35]。调整光交联的条件对 GelMA 的特性也有显著影响。这些条件参数包括曝光时间，光照强度和引发剂浓度。GelMA 的降解主要由酶促反应引起，尤其是基质金属蛋白酶，通常由封装在水凝胶中的软骨细胞分泌，故平衡水凝胶降解速率与基质金属蛋白酶的分泌量也是需要被深入研究的课题。

GelMA 具有良好的促细胞黏附和增殖特性。先前的研究显示，由于 GelMA 的生物组织相容性、力学特性及含有多肽序列，在 2D 和 3D 的细胞培养实验中都能充当培养基使用[36]。如细胞可以在 GelMA 溶液中单层培养，也可以在 GelMA 经紫外线光交联后构建负载细胞的 3D 培养体系，且细胞存活率基本＞80%。而与 2D 单层培养不同的是，3D 水凝胶中的细胞能改变其周围环境并使之适于迁移[37]。此外，3D 坏境中细胞行为更接近其在天然组织中的表现，由于 GelMA 与细胞外基质高度的相似性，而使之成为细胞 3D 培养体系的研究热点[38-40]。

三、GelMA 在软骨损伤修复中的应用

虽然软骨细胞常用于修复软骨损伤，但其在单层培养中会发生去分化现象而限制了其产生透明软骨的能力。现在有越来越多的证据表明，与传统的细胞单层培养相比，在 3D 环境中生长的软骨细胞更能维持自身形态和表型，3D 体系所模拟的生理环境使得软骨细胞能够产生正常软骨组织[41-42]。软骨细胞是锚定依赖性细胞，在培养板上生长需要黏附于材料表面，通常呈扁平状铺展。而在水凝胶支架中，软骨细胞形态为圆形或卵圆形，与其在天然软骨基质中相近，因而有利于维持正常表型。有研究表明，生长状态成圆形或卵圆形的间充质干细胞也更倾向于向软骨细胞分化。

标准的软骨细胞培养方式为细胞团块培养，在 3D 环境中团块内细胞间的直接接触会促进软骨细胞保持分化状态[34]。现在，水凝胶被广泛用于构建 3D 细胞培养，以此研究细胞外基质、细胞－细胞接触效应以及细胞增殖、迁移和分化等课题[43]。Sridharan 等[34]比较了兔骨髓间充质干细胞在水凝胶 3D 结构中团块培养和单细胞悬液培养的结果，证实团块培养可以加强细胞生物合成和生成软骨的能力，且团块内细胞数量越多，合成能力越强。

四、GelMA 复合支架的研究

由于水凝胶与细胞外基质高度的相似性，组织工程对其展开了大量的研究。人工合成材料水凝胶有着良好的力学特性，但其缺乏生物活性。而生物材料水凝胶的生物学特性虽可以满足细胞要求，但缺少机械强度和力学可控性。因此，选用单一材料制备的生物支架效果并不理想，而复合支架逐渐成为研究热点。GelMA 的生物相容性和降解性极佳，多项研究对 GelMA 复合材料进行了探究，并获得较为满意的结果。

五、GelMA 与其它生物材料结合

软骨细胞在不同种类的水凝胶中表现各异[44]，Levett等[44]研究了常用于软骨修复工程的四种水凝胶——明胶，透明质酸，聚乙二醇和藻酸盐。作者将四种水凝胶分别修饰甲基丙烯酸酐以使其具有光交联能力，而后将软骨细胞封装其中进行 3D 培养。研究显示，明胶水凝胶促进了细胞增殖和糖胺聚糖基质的沉积，此基质能显著改变水凝胶的力学强度。但明胶中的部分细胞由于发生去分化现象而分泌 I 型胶原。软骨细胞在透明质酸水凝胶组再分化状态最佳，但其新生成的基质仅集中在细胞周围区域。随后，Levett 等[45]将明胶和透明质酸结合构成了 GelMA / HAMA ( 甲基丙烯酰胺基透明质酸 ) 复合水凝胶，随后作者将人软骨细胞置于 GelMA / HAMA 中培养，并通过基因检测和免疫荧光检测证实该复合支架能加强细胞成软骨能力。此外，作者还发现在 GelMA / HAMA 中，软骨细胞维持了圆形的细胞表型并使 ECM 的分泌量增加。

Suo 等[46]通过负载丙烯酰胺基葡萄糖 ( AGA ) 的光交联明胶水凝胶来调节 GelMA 的性质。随后对 GelMA / AGA 进行流变学和微形态检测，结果显示该水凝胶膨胀率、明胶溶解度及水凝胶降解率降低。这些特性的改变使GelMA / AGA 更为稳定。此外，AGA 毒性比单纯氨基葡萄糖低，在细胞毒性实验中，水凝胶溶解所释放的 AGA 未引起细胞凋亡增加，因此适当增加 AGA 含量可促进软骨细胞生长。

Visser 等[47]将马软骨、半月板和肌腱组织经脱细胞处理后溶解，修饰甲基丙烯酸酐并与 GelMA 构成复合水凝胶。而后分别加入马软骨细胞和骨髓间充质干细胞培养。结果显示，三组新型水凝胶均无细胞毒性，但封装软骨细胞的三组水凝胶中 DNA、糖胺聚糖、II 型胶原含量均不如对照组 ( 单纯 GelMA 组 )。而封装骨髓间充质干细胞的三组水凝胶结果和对照组相似，且糖胺聚糖 / DNA 比值较对照组高，但差异无统计学意义。该实验尽管未能证明上述三种复合水凝胶有更好的软骨修复能力，但间接证明了骨髓间充质干细胞成软骨能力比单纯软骨细胞更优。另有文献指出，软骨细胞和骨髓间充质干细胞共培养能更好地引导间充质干细胞向软骨细胞分化[48]。

六、GelMA 与合成材料结合

Gao 等[49]制备的光交联二 PEG ( 甲基丙烯酸聚乙二醇酯 ) / GelMA 比单纯 GelMA 的压缩模量高 10倍。运用喷墨式生物打印机将间充质干细胞均匀分布在 PEG / GelMA支架上培养 21天后，其 SOX9表达量、II 型胶原和蛋白多糖含量均有显著性增加。Boere 等[39]将聚甲基丙烯酰基－聚 ( 羟甲基己交酯－ε－己内酯 )－聚 ( ε－己内酯 ) ( pMHMGCL / PCL ) 与 GelMA 通过紫外线聚合共价交联构成复合水凝胶。将该水凝胶填充入关节软骨缺损模型后光交联固化，随后对其施加模拟正常关节运动的轴向及转动力量，检测数据显示的其抵抗力较单纯 GelMA 组有显著提高，且检测到大量的 II 型胶原在支架和自身组织交界处沉积。体外软骨细胞 3D 培养 6周后，通过免疫荧光检测证实软骨细胞可产生软骨特异性基质。

软骨基质钙化区是软骨的最深层结构，其 II 型胶原含量只占 20%，而 65% 为羟磷灰石 ( HAP )，与软骨下骨接近 ( 86% )[50]，故软骨钙化区具有较高的硬度，但生软骨能力较低。Bartnikowski 等[51]将藻酸盐 / HAP，GelMA以及 GelMA / HAMA 相互组合，构成 GelMA－藻酸盐 / HAP，GelMA / HAMA－藻酸盐 / HAP 两种新型复合水凝胶，以期在增加水凝胶机械强度的同时，不影响软骨细胞的增殖与合成。随后作者将软骨细胞封装其中，并用光交联构成 3D 培养体系。培养后第 1天细胞活性检测为 80%存活率，故细胞毒性较低。在细胞培养期间，两组复合水凝胶的弹性模量显著大于对照组 ( GelMA－藻酸盐组 )。而培养 28天的结果显示两组新型水凝胶并未对软骨细胞存在消极影响。综上所述，作者认为该复合水凝胶可以作为软骨修复支架的基础而进行进一步的研究。

总之，GelMA 在软骨修复组织工程领域中将发挥重要作用。将天然明胶通过化学修饰甲基丙烯酸酐后，经紫外光照交联形成的 GelMA 不仅具有良好的生物组织相容性和降解率，同时也与天然的软骨细胞外基质高度相似，这有利于细胞代谢及生物合成。水凝胶中的广泛存在细胞黏附位点可以使封装在内的细胞扩散迁移，也可促进外周细胞的长入。GelMA 拥有的以上特点是其作为生物材料的基础。

由于水凝胶修饰了甲基丙烯酸酐而使其具有了可调控的力学特性，为封装的细胞提供了保护和支撑，但其强度仍不能与天然软骨相当。借助其它生物或合成材料的高强度特点与 GelMA 相结合所形成的复合支架，能有效解决GelMA 力学强度不足的缺陷。但高强度的材料往往具有较差的生物组织相容性和难以调控的降解率，故如何选择材料及平衡两者之间的比例还需要不断的探索和尝试。

目前，对于 GelMA 支架的研究很多，而如何将其转化进入临床则是研究者们面临的共同问题。现在缺乏对该水凝胶制备过程中各种条件参数的共识，包括 GelMA 的合成标准，与其它材料的结合标准以及水凝胶 3D 细胞培养的流程。比如目前交联的金标准是紫外光配合光引发剂Irgacure 2959，但对于紫外线波长、光照时间和 Irgacure 2959的浓度却还无定论。且由于紫外线本身存在的缺陷，将来是否利用可见光代替也在进一步研究中。因此，上述亟待解决的问题可为今后的研究指明方向，为转化临床应用提供基础。

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( 本文编辑：李贵存 )

A brief review of gelatin-methacryloyl hydrogels for the therapeutical application of articular cartilage defect repair

ZHANG Chuan-xin, LI Liang, WU Hai-shan.
Department of Joint Surgery, Changzheng Hospital, the Second Military Medical University, Shanghai, 200003, China Corresponding author: WU Hai-shan, Email: drisland@vip.sina.com

Tissue engineering has made promising progresses in the aspect of cartilage repair in nearly two decades. The use of hydrogel-based scaffolds not only promotes the extracellular environment for 3D cell culture, but also provides suitable mechanical properties. Among all kinds of hydrogels, gelatin methacryloyl hydrogels ( GelMA ) have gained great interest due to their appropriate biological properties and tunable physicochemical characteristics. This photocrosslinkable hydrogels can crosslink to form networks with tunable mechanical properties when exposed to UV light. GelMA highly mimics extracellular matrix ( ECM ) so that they can facilitate cell-attaching and retain metalloproteinase responsive peptide motifs. These characteristics allow chondrocytes to proliferate and spread in hydrogels, and contribute to self-degradation. Hybrid hydrogels can be fabricated by mixing GelMA with other polymers combineing biocompatibility and mechanical strength. GelMA plays a critical pioneering role in the fi eld of articular cartilage repair and has promising prospects in clinical applications.

Tissue engineering; Cartilage, articular; Cell culture techniques; Hydrogels; Injuries, cartilage; Gelatin methacryloyl hydrogels

10.3969/j.issn.2095-252X.2017.08.015

R681.3, R318

200003 上海，第二军医大学附属长征医院关节外科

吴海山，Email: drisland@vip.sina.com

2016-10-27)