九味补血口服液质量标准研究

黄若干　裴泽建　黄平权　蓝晓东　覃佩莉　梁杰敏　林海英　王小红

【摘 要】 目的：提高九味补血口服液质量标准。方法：采用薄层色谱法对人参、绞股蓝、黄芪进行定性鉴别，采用HPLC法对五味子中五味子醇甲进行定量分析。结果：人参与绞股蓝、黄芪的薄层色谱均具有特征性的清晰斑点，阴性溶液无干扰；五味子醇甲在005100～15300μg范围内其峰面积与进样量呈良好的线性关系，平均加样回收率为10097%（RSD=091%）。结论：研究建立的定性鉴别与定量分析方法灵敏、准确，具有良好专属性和重现性，更能有效控制九味补血口服液的质量。

【关键词】 九味补血口服液；人参；绞股蓝；黄芪；五味子醇甲

【中图分类号】R284 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2016）23-0016-04

九味补血口服液由人参、黄芪、绞股蓝、当归等药味组成，具有益气补血、健脾益胃的功效。原标准只建立当归、甘草、陈皮的薄层色谱鉴别和正丁醇提取物测定方法，方中君药人参、黄芪等均未建立有定性或定量的质控指标，为能更加有效控制本品质量，实验开展人参、黄芪、绞股蓝薄层色谱鉴别研究和五味子中五味子醇甲HPLC测定研究。

1 仪器与材料

11 仪器 LC-10ATVP高效液相色谱仪（日本岛津）。

12 材料 人参皂苷Rb1（批号：110704-200318）、人参皂苷Rg1（批号：110713-200322）、黄芪甲苷（批号：0781-200109）、五味子醇甲（批号：110857-201513）对照品、人参（批号：120917-200406）、绞股蓝（批号：121311-200402）对照药材均购自中国药品生物制品检定研究院；九味补血口服液（批号：131201、131202、131203，广西盈康药业有限责任公司）。乙腈、磷酸为色谱醇；水为纯化水；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

21 薄层色谱鉴别

211 人参和绞股蓝的薄层鉴别 取本品30mL，加三氯甲烷30mL，振摇提取，分取上层溶液，用水饱和的正丁醇振摇提取3次（30mL，30mL，20mL），合并正丁醇提取液，用氨试液提取2次，每次50mL，再用正丁醇饱和的水洗涤2次，每次50mL，分取正丁醇液，蒸干，残渣加10%乙醇5mL使溶解，通过D101型大孔吸附树脂柱（内径15cm，长12cm），用水50mL洗脱，弃去水洗脱液，再用40%乙醇30mL洗脱，弃去40%乙醇洗脱液，继用70%乙醇50mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣用甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液。另取人参对照药材08g和绞股蓝对照药材2g，同法制备成对照药材溶液；再取人参皂苷Rb1、Rg1对照品加甲醇制成每1mL各含1mg的对照品溶液。按处方比例制备缺人参、绞股蓝的阴性样品，同法制成阴性溶液。照薄层色谱法（中国药典2015版四部通则0502）试验，吸取上述溶液各1～2μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水（13∶[KG-*3/5]7∶[KG-*3/5]2）10℃以下放置分层的下层溶液为展开剂[1]8，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。置日光下检视，供试品色谱中，分别与对照品、对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；置紫外光（365nm）下检视，供试品色谱中，在与对照品、对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性无干扰。见图1。

212 黄芪的薄层鉴别 取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液。取211项的供试品溶液作为供试品溶液。按本品制法制备缺黄芪阴性样品，同法制备阴性溶液。照薄层色谱法（中国药典2015版四部通则0502）试验，吸取上述对照品溶液、供试品溶液、阴性溶液各1～2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以（正丁醇-乙酸乙酯-水（4∶1∶5）上层溶液）-甲醇（10∶1）[1]302为展开剂，置氨气饱和的层析缸内，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯（365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性试验无干扰。见图2。

22 五味子醇甲的含量测定[1]66

221 色谱条件及系统适用性 照中国药典2015版四部通则0512高效液相色谱法，色谱柱为日本岛津公司BDS C18柱（46mm×250mm，5μm）；以甲醇-水（60∶[KG-*3/5]40）为流动相；检测波长为250nm；理论板数按五味子醇甲峰计算应不低于1500。

222 溶液的配制 ①对照品溶液制备：精密称取五味子醇甲对照品适量，加甲醇制成每1mL含50μg的对照品溶液。②供试品溶液制备：精密量取本品10mL，置分液漏斗中，加水20mL，混匀，用乙酸乙酯振摇提取4次，每次30mL，合并乙酸乙酯液，置水浴上蒸干，残渣分次加甲醇适量使溶解并转移至10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。③阴性样品溶液制备：按标准处方工艺制备不含五味子的阴性样品，再按供试品溶液制备方法制备成阴性样品溶液。

分别精密吸取上述溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，专属性试验色谱图见图3、4、5。试验结果表明，供试品色谱图中，在与对照品色谱图相应的位置有相应的色谱峰出现，且该色谱峰和其他组分色谱峰分离度符合规定，阴性样无干扰，说明该方法的系统适用性和专属性良好。

223 线性关系试验 精密称取五味子醇甲对照品1275mg，置50mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液（含五味子醇甲02550mg/mL），精密量取该贮备液05mL、25mL、50mL、75mL、10mL、125mL、15mL分别置25mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，分别精密吸取上述对照液各10μL注入液相色谱仪，结果峰面积分别为97065、497390、993624、1500990、2016087、2520814、3022343。以五味子醇甲峰面积（A）为横坐标，对照品进样量（μg）为纵坐标，进行线性回归，得回归方程：Y=50460×10-7X -00047（r=09999，n=7）。结果五味子醇甲在005100～15300μg范围之间线性关系良好。

224 精密度试验 精密吸取同一批样品的供试品溶液10μL注入液相色谱仪，重复进样6次，记录五味子醇甲色谱图及峰面积，分别为1075998、1067577、1065693、1067843、1079951、1082658，平均峰面积1073287，RSD为067%（n=6），表明精密度良好，符合要求。

225 重复性试验 取本品同一批号的样品，照含量测定项下供试品溶液制备方法平行制备6份供试品溶液，在上述色谱条件下，精密吸取供试品溶液和对照品溶液各10μL注入液相色谱仪，记录色谱图，计算含量分别为5406、5379、5413、5384、5376、5425μg/mL，平均5397μg/mL，RSD为038%（n=6），说明重复性良好。

226 稳定性试验 照上述供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下，取该供试品溶液分别于0h、4h、8h、16h、24h测定峰面积，分别为1076001、1069854、1072581、1070732、1078765、1069781，平均1072952，RSD为034%。表明供试品溶液24h内稳定性良好。

226 加样回收试验 取已知五味子醇甲含量的本品同一样品（批号：131201，含量为5397μg/mL），精密量取5mL，加水25mL，共9份，分别精密加入对照品贮备液（浓度为01376mg/mL）1mL、2mL、3mL，低、中、高浓度各3份，照供试品溶液制备项下的方法处理、测定。结果表明，本法加样回收率相对标准偏差符合标准规定。结果见表1。

227 样品的含量测定 按上述含量测定方法测定了本品10批样品五味子醇甲的含量，结果分别为540、617、456、731、542、428、419、563、647、692μg/mL。

3 讨论

31 人参中含有多种人参皂苷，绞股蓝中主要含四环三萜皂苷，其中多种皂苷结构与人参皂苷相同，如人参皂苷Rb1、Rd、Rb3和F2等[2]，为方便实验操作，故在预试验时就设计采用同一方法同时对这两味药材进行薄层鉴别。在进行人参、绞股蓝薄层鉴别预试验摸索过程中，曾尝试使用过（正丁醇-乙酸乙酯-水（4∶[KG-*3/5]1∶[KG-*3/5]5）上层溶液）-甲醇（10∶[KG-*3/5]1）、三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（15∶[KG-*3/5]40∶[KG-*3/5]22∶[KG-*3/5]10）等展开剂，但因制剂中含皂苷成分太多，分离效果均不够理想，最终以三氯甲烷-甲醇-水（13∶[KG-*3/5]7∶[KG-*3/5]2）10℃以下放置分层的下层溶液为展开剂最为理想，在此条件下，斑点能较好的分离且清晰圆整，Rf值适宜，方法简便，重现性好。

32 《中国药典》中黄芪使用黄芪甲苷作为对照品进行薄层鉴别，我们也拟定采用黄芪甲苷作为本药材的鉴定指标。在进行黄芪薄层鉴别预试验时，曾尝试使用三氯甲烷-甲醇-水（13∶7∶2）的下层溶液、三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（15∶40∶22∶10）10℃以下放置的下层液等展开剂，分离效果均不够理想，最终以（正丁醇-乙酸乙酯-水（4∶1∶5）上层溶液）-甲醇（10∶1）为展开剂最为理想，此法重现性好，专属性强。

33 在进行本试验的含量测定方法摸索时，曾尝试使用HPLC法对方中的人参、绞股蓝建立含量测定方法，以人参皂苷Rb1、Rg1对照品为含测指标，但阴性样有干扰而无法建立。五味子醇甲含测方法流动相经选择甲醇-水不同比例进行比较，最终甲醇-水的比例为60∶40时主成分峰分离度、峰形最佳；五味子醇甲甲醇溶液在250nm处有最大吸收而选择此波长作为检测波长；对于供试品溶液的制备，曾选用乙醚、乙酸乙酯对样品进行萃取处理，结果乙醚萃取乳化严重，而乙酸乙酯萃取效果良好而被选用。

本试验对方中的人参、绞股蓝、黄芪等药味进行定性鉴别和对五味子醇甲进行定量测定，方法灵敏、准确，具有较好专属性和重现性，为九味补血口服液提升质量控制方法提供具有参考价值的科学依据。从测定的10批样品中五味子醇甲的含量来看，五味子醇甲的最低含量为419μg/mL，最高为731μg/mL。造成样品中五味子醇甲含量高低不均的原因，应该是五味子药材不同批次之间因产地、采收季节、贮藏等因素的影响而使五味子醇甲含量存在差异性，因此在投料生产时要把好药材质量关，以保证制剂质量的稳定性。

参考文献

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[S].北京：中国医药科技出版社，2015：8，302，66.

[2]国家中医药管理局中华本草编委会.中华本草[M].上海：上海科技出版社，1999：533.

（编辑：程鹏飞）