上皮间质转化相关标志物在舌鳞癌组织中的表达及其临床意义研究

朱名毅 姚金光 高洁△ 卢露碧 刘津

(1.右江民族医学院，广西 百色 533000；2.右江民族医学院附属医院，广西 百色 533000)



上皮间质转化相关标志物在舌鳞癌组织中的表达及其临床意义研究

朱名毅1姚金光2高洁1△卢露碧1刘津2

(1.右江民族医学院，广西 百色 533000；2.右江民族医学院附属医院，广西 百色 533000)

目的 探讨上皮间质转化标志物锌指E-盒结合同源异形盒-1(ZEB1)、E-钙黏蛋白 (E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)在舌鳞癌组织中的表达及其临床意义。方法 采用免疫组织化学Streptavidin-Peroxidase(SP)法检测68例舌鳞癌组织、63例舌癌癌旁组织和68例正常舌上皮组织中ZEB1、E-cadherin、和N-cadherin的表达情况，并分析其表达与患者临床病理特征及转移的关系。结果 ZEB1、E-cadherin蛋白在舌鳞癌组织中的阳性表达率低于癌旁组织、正常上皮组织(P<0.05)；而N-cadherin蛋白在舌鳞癌组织中的阳性表达率高于癌旁组织、正常上皮组织(P<0.05)。舌鳞癌组织中ZEB1、E-cadherin和N-cadherin蛋白的阳性表达率在不同肿瘤TNM分期、肿瘤分化程度及有无淋巴结转移间比较差异有统计学意义 (P<0.05)。舌癌组织中ZEB1蛋白的阳性表达与E-cadherin蛋白阳性表达呈正相关；ZEB1蛋白的阳性表达与N-cadherin阳性蛋白表达呈负相关。结论 ZEB1、E-cadherin和N-cadherin在舌鳞癌演变过程起重要的作用，可能参与了舌鳞癌侵袭和转移的过程。

舌鳞癌； E-盒结合同源异形盒-1； E-钙黏蛋白； N-钙黏蛋白； 上皮间质转化

舌鳞状细胞癌是口腔颌面外科最常见的恶性肿瘤之一，其易通过淋巴管和血管发生转移，手术难以彻底清除转移的肿瘤细胞，而且转移的细胞会抵抗后续的放疗、化疗等治疗措施，从而引起肿瘤的复发[1]。有研究[2]报道上皮间质转化(EMT)在肿瘤侵袭、转移等过程中发挥重要的作用，但上皮间质转化在舌磷癌转移方面的研究还比较少。我们拟采用免疫组织化学SP检测核转录因子ZEB1和EMT相关标志物(E-cadherin、N-cadherin)在正常舌黏膜鳞状上皮组织、舌鳞癌组织及癌旁组织中的表达情况，并探讨它们与舌鳞癌患者临床病理因素之间的相关性，为阐明舌鳞癌浸润转移的分子机制及评价这些指标在舌鳞癌生物学中的作用提供实验依据。

1 对象与方法

1.1 对象及标本来源 采用回顾性队列研究，收集右江民族医学院附属医院2010年1月至2013年9月手术切除的存档舌鳞癌组织标本68例。所有病例术前均未经过化疗、放疗或其他治疗措施，组织病理学证实均为鳞状细胞癌。在68例癌标本中选取癌旁组织63例和正常舌鳞状上皮组织68例(距离肿瘤边缘5 cm以上)。

1.2 研究方法 手术切除的标本用4%中性甲醛固定，常规石蜡包埋，按4 μm厚度做石蜡标本切片，用SP法严格按照免疫组化试剂盒说明书进行免疫组化，然后在同等光源的条件下对标本免疫组化的结果在显微镜下拍照。阳性对照为已知的组织阳性切片，阴性对照为磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗。鼠抗人ZEB1单克隆抗体购自美国sigma公司，E-cadherin和N-cadherin鼠抗人单克隆一抗、链霉菌抗生素蛋白-过氧化物酶(SP)二抗试剂盒、二氨基联苯胺(DAB)显色剂均购自福州迈新公司。

1.3 免疫组化结果的评定 ZEB1蛋白主要表达于细胞核，E-cadherin和N-cadherin蛋白主要表达于细胞膜或细胞质，黄色或棕黄色颗粒为阳性细胞，着色明显高于背景。结果评估采用半定量积分法，即根据每张切片的染色范围和染色强度进行综合评定。染色强度评分：棕褐色(强染色)，3分；黄色或浅棕色(中度染色)，2分；浅黄色(低度染色)，1分；无黄色(无染色)，0分。染色范围评分：显微镜高倍视野下(×400)随机每张切片选5个视野，按阳性细胞占同类细胞百分比计分，阳性细胞数>50%，3分；25%～50%，2分；5%～<25%，1分；<5%，0分。将两个分值相乘做为每个病例的总积分，总积分>3分为阳性，总积分≤3分为阴性。阴性对照用PBS代替一抗。

1.4 统计学方法 应用SPSS17.0软件对实验数据进行统计学分析。实验的计数资料采用卡方检验进行组间比较，采用Spearman等级相关分析进行计数资料的相关性分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 ZEB1、E-cadherin和N-cadherin蛋白的表达情况 舌鳞癌组中ZEB1和E-cadherin阳性表达率均低于癌旁组织组和正常舌组织组，三组间阳性表达率差异有统计学意义(P<0.05)；舌鳞癌组中N-cadherin阳性表达率高于癌旁组织组和正常舌组织组，三组间阳性表达率差异有统计学意(P<0.05)，见表1。

表1 E-cadherin、N-cadherin和ZEB1在舌癌相关组织中的阳性表达情况

2.2 舌鳞癌组织中ZEB1、E-cadherin和N-cadherin表达与临床病理特征的关系 ZEB1、E-cadherin和N-cadherin的阳性表达在不同性别和肿瘤大小间差异均无统计学意义(P>0.05)；在不同肿瘤TNM分期、肿瘤分化程度及淋巴结转移情况下，ZEB1、E-cadherin和N-cadherin 在舌鳞癌组织中的阳性表达差异均有统计学意义(P<0.05)。这些结果表明ZEB1、E-cadherin 和N-cadherin蛋白表达高低可作为舌鳞癌恶性程度、转移情况等临床病理学特征的判断标志物之一，见表2。

表2 ZEB1、E-cadherin和N-cadherin表达与舌鳞癌患者临床病理特征的关系

注：组间比较，*P<0.05。

2.3 舌鳞癌组织中ZEB1表达与E-cadherin和N-cadherin表达的相关性 68例舌癌组织中，ZEB1阳性18例，阴性50例。在18例ZEB1阳性的舌癌组织中E-cadherin阳性17例，两者呈正相关(r=0.608，P=0.000)；在18例ZEB1阳性的舌癌组织中N-cadherin阳性3例，两者呈负相关(r=-0.773，P=0.000)。而在50例N-cadherin阳性的舌癌组织中E-cadherin阳性13例，两者呈负相关(r=-0.608，P=0.000)。

3 讨 论

舌鳞癌的预后与肿瘤组织分化程度、TNM分期、肿瘤大小和淋巴结转移等因素密切相关，其中肿瘤的病理分级和淋巴结转移是影响和评价患者预后的最重要的因素[1]。但是舌鳞癌的转移过程非常复杂，近年来开始从分子生物学的信号转导和基因表达方面，对参与舌磷癌侵润转移的信号转导途径、核转录因子和细胞因子有一些初步的认识，但是，上皮间质转化在舌磷癌转移的作用机制还不是很清楚。近几年发现上皮间质转化是肿瘤侵袭和转移中的关键环节，EMT是指上皮源细胞通过改变细胞形态、减少细胞间黏附等方式，转变成为具有活动能力的间质细胞，从而获得向周围侵袭和迁移的能力。恶性肿瘤细胞发生EMT后，其侵袭和转移的能力得到提高。EMT参与肺癌、前列腺癌、乳腺癌、结肠癌、胰腺癌、肝癌等癌症的原发性浸润或继发性转移过程[3]。

上皮间质转化转录因子ZEB1主要通过对E-钙黏蛋白及N-钙黏蛋白的调节作用，调节细胞间粘附作用从而促进肿瘤细胞的侵袭转移能力，该机制己在多种肿瘤细胞中(胰腺癌、大肠癌及乳腺癌)所证实，转染抑制细胞的ZEB1和ZEB2后，诱导N-钙黏蛋白和波形蛋白的表达上调及E-钙黏蛋白的表达下调[4]。E-钙黏蛋白是钙依赖性细胞间粘附分子，对建立和维持细胞间连接以及参与细胞间信号传递有重要作用。作为上皮细胞主要粘附分子，E-钙黏蛋白正常表达时，上皮细胞间都保持良好的相互连接，肿瘤细胞很少发生转移，但是E-钙黏蛋白表达下调时则会引起肿瘤细胞从原发部位脱落[5]。N-钙黏蛋白也是一种跨膜黏附分子，常表达于神经外胚层和中胚层来源的组织，正常上皮组织低表达。发生EMT的癌细胞则出现N-钙黏蛋白的反常高表达，从而促使癌细胞从癌组织块上脱离，进一步与内皮或基质成分黏附，最终提高肿瘤细胞的侵袭转移能力[6]。

本研究结果表明，从正常舌上皮组织到最终的舌鳞癌的发生发展过程中，ZEB1和E-cadherin蛋白的表达依次增高，且在癌旁组织中其表达就开始下降；但是N-cadherin蛋白的表达依次增高，且在癌旁不典型增生组织中其表达就开始上调，表明上皮间质转化过程可能是舌鳞状细胞癌发生的早期事件，也就是说上皮间质转化参与了舌鳞癌的发生和形成。

本研究结果显示，ZEB1、E-cadherin和N-cadherin蛋白的表达与病人性别及肿瘤大小无关(P>0.05)，而与舌鳞癌TNM分期、组织学分化及淋巴结转移有关(P<0.05)。ZEB1和E-cadherin在舌癌组织早期(Ⅰ+Ⅱ期)的阳性表达率均高于其在晚期(Ⅲ+Ⅳ期)的阳性表达率，说明舌鳞癌进展程度越高，ZEB1和E-cadherin的表达越低。但是，N-cadherin在舌癌组织早期(Ⅰ+Ⅱ期)的阳性表达率均低于晚期(Ⅲ+Ⅳ期)的阳性表达率，说明舌鳞癌进展程度越高，N-cadherin的表达越高。此外，本研究结果表明舌鳞癌分化程度越低，其肿瘤的恶性程度越高，ZEB1和E-cadherin蛋白的表达越低，而N-cadherin蛋白的表达越高，因此ZEB1、E-cadherin和N-cadherin蛋白表达的高低可以作为衡量舌鳞癌恶性程度的标志之一。我们还发现，ZEB1、E-cadherin和N-cadherin的表达也与是否发生淋巴结转移有关，ZEB1和E-cadherin蛋白在有淋巴转移组中的阳性表达率低于无淋巴转移组，而N-cadherin蛋白在有淋巴转移组中的阳性表达率高于无淋巴转移组，均有显著性统计学差异(P<0.05)。因此，我们认为ZEB1、E-cadherin和N-cadherin蛋白表达的高低有可能成为临床判断舌鳞癌是否转移的标志。

在进一步的相关性分析中我们发现，ZEB1的表达与E-cadherin呈现出正相关，而与N-cadherin的表达呈现出负相关；但是E-cadherin表达与N-cadherin的表达呈现出负相关。由此我们认为，临床上对ZEB1、E-cadherin和N-cadherin的联合免疫组化检测更加有利于准确判断舌鳞癌的恶性程度及其转移情况。

综上所述，我们推测ZEB1可能通过调控E-cadherin和N-cadherin在舌鳞癌组织中的表达，进而影响舌鳞癌的发生、发展和转移，但是其确切机制尚需要进一步阐明。因此对其进行更加深入细致的研究，将有助于预防舌鳞癌的复发，提高舌鳞癌患者的预后、存活率及生存质量等。

[1] 何升腾.1171例舌癌的治疗与预后分析[D].哈尔滨医科大学,2014.

[2] Iwanami T,Uramoto H,Nakagawa M，et al.Clinical significance of epithelial-mesenchymal transition-associated markers in malignant pleural mesothelioma[J].Oncology，2014，86(2):109-116.

[3] Lamouille S, Xu J, Derynck R，et al. Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition[J]. Nat Rev Mol Cell Biol，2014,15(3):178-196.

[4] Zhang P, Sun Y, Ma L，et al.ZEB1: at the crossroads of epithelial-mesenchymal transition, metastasis and therapy resistance[J]. Cell Cycle，2015，14(4):481-487.

[5] Sridevi U, Jain A, Nagalaxmi V，et al.Expression of E-cadherin in normal oral mucosa, in oral precancerous lesions and in oral carcinomas[J]. Eur J Dent，2015，9(3):364-372.

[6] Liang S, Salas T, Gencaslan E，et al.Tuberin-deficiency downregulates N-cadherin and upregulates vimentin in kidney tumor of TSC patients[J].Oncotarget，2014，5(16):6936-6946.

Expression and Clinical Significance of Epithelial-mesenchymal transition (EMT) markers in tongue squamous cell carcinoma

ZhuMingyi1,YaoJinguang2,GaoJie1,LuLubi1,LiuJin2.

1.YoujiangMedicalUniversityForNationalities,Baise533000,China. 2.AffiliatedHospitalofYoujiangMedicalUniversityForNationalities,Baise533000,China.

Objective To investigate the expressions of Epithelial mesenchymal transition (EMT) markers Zinc Finger E-Box Binding Homeobox 1(ZEB1), E-cadherin and N-cadherin in tongue squamous cell carcinoma, and their clinical significances thereof. Methods Immunohistochemical streptavidin-peroxidase method was applied to detect expressions of ZEB1, E-cadherin and N-cadherin in 68 samples of tongue squamous cell carcinoma, 63 samples of tongue cancer adjacent tissues and 68 samples of normal tongue epithelium tissues. Correlations of expressions of ZEB1, E-cadherin and N-cadherin to clinical pathological parameters and metastasis were analyzed in three groups. Results The expression positive rates of ZEB1 and E-cadherin were significantly lower in tongue squamous cell carcinoma than those in tongue cancer adjacent tissues and normal tongue epithelium tissues(P<0.05). The expression positive rates of N-cadherin were significantly higher in tongue squamous cell carcinoma than those in tongue cancer adjacent tissues and normal tongue epithelium tissues(P<0.05). There were statistical significantly differences in the expression of ZEB1, E-cadherin and N-cadherin between different TNM stages, differentiation and lymph node metastasis in tongue squamous cell carcinoma (P<0.05). The positive expression of ZEB1 was positively correlated with the positive expression of E-cadherin. The positive expression of ZEB1 was negatively correlated with the positive expression of E-cadherin. Conclusion ZEB1, E-cadherin and N-cadherin play an important role in evolution of tongue squamous cell, it may be involved in the process of tongue squamous cell invasion and metastasis.

Tongue squamous cell carcinoma； Zinc Finger E-Box Binding Homeobox1； E-cadherin； N-cadherin； Epithelial mesenchymal transition

广西高等学校科研项目[桂教科研(2012)10号]

R739.86

A

1000-744X(2016)03-0243-03

2015-09-21)

△通信作者，E-mail:278793730@qq.com