大黄素可通过下调NF-κB的表达逆转胰腺癌吉西他滨耐药细胞株的耐药作用

张言涛 成伯宁 刘殿雷 黄 海 沈肖曹*

大黄素（Emodin，6-甲基-1，3，8-三羟基蒽醌）是从大黄属、蓼属、鼠李属和番泻叶中分离出来的主要有效单体，是一种酪氨酸激酶Ⅱ抑制剂；其具有抗微生物活性、抗炎、免疫抑制、抗肿瘤、保护肝细胞等作用；据有关报道，大黄素作用于癌细胞中结构性地激活和放大的癌基因信号转导通路，因此大黄素的细胞毒作用主要对癌细胞有效，正常细胞则不敏感，因此大黄素对正常细胞的毒副作用较小。最新报道显示，低浓度大黄素可以增强卵巢癌细胞对紫杉醇化疗的敏感性［1］。本课题组先前已发现大黄素显著增强吉西他滨对胰腺癌的促凋亡作用［2］；但大黄素是否具有逆转胰腺癌细胞对吉西他滨化疗的耐药作用尚不明确，因此本研究探讨大黄素是否具有逆转胰腺癌耐药细胞株Bxpc-3/Gem的耐药作用及其可能的逆转机制。

1 材料与方法

1.1 主要药品和试剂 大黄素（纯度＞98%）、吉西他滨（美国礼来公司）；胎牛血清、含EDTA 胰酶、RPMI-1640培养基（美国Gibco 公司）；NF-κB抗体（美国Santa Cruz）。药物配制：大黄素用DMSO配制成0.2mmol/L，-20℃冰箱保存，DMSO终浓度＜0.1%；吉西他滨用无菌生理盐水配制成0.02mmol/L。

1.2 细胞培养 人胰腺癌细胞株Bxpc-3购自ATCC，培养于含10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI1640培养基中，37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养；Bxpc-3/GEM是采用浓度梯度倍增法诱导建立耐药细胞株Bxpc-3/Gem。

1.3 不同浓度大黄素对Bxpc-3/Gem和Bxpc-3细胞增殖的抑制作用 收集处于对数生长期的Bxpc-3/Gem和Bxpc-3细胞，用完全培养基配制成单细胞悬液，以每孔4×103的细胞数接种至96孔板，放入CO2培养箱37℃培养过夜后，分别给予不同浓度的大黄素（10、20、40、80、160μm）处理，并设正、负对照组。药物处理48h后，弃上清液，每孔各加入180μl培养液和20μl MTT（5mg/ml）溶液，继续培养4h，小心吸弃培养液，每孔加入DMSO150μl，振荡器震荡10min，选择波长490nm用全自动酶联免疫检测仪测定每孔吸光度（A）。每组设6个复孔，实验重复3次。计算细胞存活率。细胞存活率=实验组A值/对照组A值×100%。

1.4 大黄素联合吉西他滨对Bxpc-3/Gem和Bxpc-3细胞增殖的影响 Bxpc-3/Gem和Bxpc-3细胞以每孔4×103的细胞数接种至96孔板，过夜后，大黄素（40μm）与吉西他滨（20μm）单独及联合处理48h，弃上清液，加入MTT（5mg/ml）溶液，继续培养4h，吸弃培养液，加入DMSO150μl，震荡10min，测定每孔吸光度（A）。每组设6个复孔，实验重复3次。计算细胞存活率。

1.5 RT-PCR法检测大黄素及吉西他滨处理后Bxpc-3/Gem细胞中NF-κB基因的表达 大黄素（40μm）与吉西他滨（20μm）单独及联合处理Bxpc-3/Gem细胞48h后，用trizol裂解细胞，提取总RNA，紫外分光光度计260nm波长测定RNA浓度；cDNA合成按照标准方案（Fermentas cDNA第一链合成试剂盒说明书）进行，PCR反应（TIANGEN2×Taq PCR MasterMix说明书）NK-KB引物 上 游 ：5'-AGCACAGATACCACCAAGACCC-3'， 下游：5'-CCCACGCTGCTCTTCTATAGGAAC-3'，目的产物长度300 bp；PCR扩增条件为：NF-κB：94℃30s，54℃30s，72℃20s，30个循环。GAPDH作内参照；PCR产物于1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.6 EMSA 实验检测大黄素及吉西他滨处理后Bxpc-3/Gem细胞中NF-κB基因的活性 大黄素与吉西他滨单独及联合处理Bxpc-3/Gem细胞48h后，提取核蛋白（按照PIERCE的核蛋白抽提试剂盒说明书的步骤）。NF-κB探针序列：5'- AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3'；5'- GCC TGG GAA AGT CCC CTC AAC T-3'，3'端标记生物素；配置6.5% 非变性聚丙烯酰胺凝胶；恒压预电泳60min，电压120 V；取核蛋白10μg加入已计量的超纯水，室温反应20min，加入生物素标记探针后室温再反应20min；恒压电泳100min，电压120 V，电泳结束后印迹转移，用带正电荷尼龙膜380mA 恒流电转40min，转移完后将尼龙膜置于波长254nm紫外灯下交联10min；封闭液20ml室温封闭20min，将膜再用抗生物素蛋白链菌素-辣根过氧化酶结合物/封闭液（1∶300稀释液）20ml于室温孵育30min，1×洗涤液洗膜，5min/次，共20min，最后将膜放入平衡液20ml中平衡10min，化学发光数字成像。

1.7 统计学方法 采用SPSS16.0统计软件。计量资料以（s）表示，组间比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大黄素对Bxpc-3/Gem和Bxpc-3细胞增殖的抑制作用 不同浓度的大黄素（10、20、40、80、160μm）作用Bxpc-3/Gem和Bxpc-3细胞48h，MTT检测细胞增殖。大黄素对耐药细胞株Bxpc-3/Gem具有明显的增殖抑制作用，并且具有浓度依赖性。与亲本株Bxpc-3比较，大黄素对耐药株Bxpc-3/Gem的增殖抑制作用并未减弱。

不同浓度的大黄素（10、20、40、80、160μm）作用Bxpc-3/Gem和Bxpc-3细胞48h，MTT检测细胞增殖；设正、负对照组，正对照组（空白对照组）为加入等量生理盐水，负对照组为加入等量DMSO。Bxpc-3/Gem细胞各组细胞增殖率分别为：对照组（98.23±2.76）%；10μm组（92.56±2.85）%；20μm 组（84.72±3.07）%；40μm 组（68.83±2.27）%；80μm 组（59.20±2.94）%；160μm 组（46.74±1.64）%；Bxpc-3细胞各组细胞增殖率分别为：对照组（96.53±2.96）%；10μm 组（90.44±1.52）%；20μm 组（85.37±2.62）%；40μm 组（66.36±1.81）%；80μm 组（58.54±2.28）%；160μm 组（48.46±2.55）%。

2.2 大黄素可显著提高耐药细胞株Bxpc-3/Gem对吉西他滨的增殖抑制作用 大黄素（40μm）与吉西他滨（20μm）单独及联合处理Bxpc-3/Gem和Bxpc-3细胞48h；MTT检测细胞增殖，吉西他滨单独作用时，对Bxpc-3/Gem与Bxpc-3细胞的抑制率分别为11.24%与34.53%（P＜0.01）；吉西他滨联合大黄素时，对两种细胞的抑制率分别是50.74%与54.72%（P＞0.05）。由此推测大黄素能够提高胰腺癌耐药细胞株Bxpc-3/Gem对吉西他滨的敏感性。

大黄素（40μm）与吉西他滨（20μm）单独及联合处理Bxpc-3/Gem与Bxpc-3细胞48h。MTT检测细胞凋亡。Bxpc-3/Gem细胞各组细胞增殖率分别为：对照组（99.25±3.15）%；大黄素组（70.76±2.43）%；吉西他滨组（88.76±2.72）%；联合组（49.26±1.77）%；Bxpc-3细胞各组细胞增殖率分别为：对照组（97.64±3.15）%；大黄素组（68.76±2.96）%；吉西他滨组（65.47±1.85）%；联合组（45.28±2.53）%。

2.3 大黄素对Bxpc-3/Gem细胞中NF-κB mRNA基因的影响 大黄素（40μm）与吉西他滨（20μm）单独及联合处理Bxpc-3/Gem细胞48h，采用RT-PCR法检测基因的表达。大黄素单药不仅可下调Bxpc-3/Gem细胞中NF-κB的基因表达，而且大黄素与吉西他滨联合处理Bxpc-3/Gem细胞具有明显的协调作用（P＜0.05）。

2.4 DNA-binding activity of NF-kB by EMSA 大黄素（40μm）与吉西他滨（20μm）单独及联合处理Bxpc-3/Gem细胞48h，提取核蛋白后，EMSA实验检测NF-kB的活性表达；与对照组比较，大黄素显著降低NF-kB活性的表达，吉西他滨增加NF-kB活性的表达，大黄素联合吉西他滨也明显降低NF-kB活性的表达（P＜0.05）。

3 讨论

胰腺癌是一种常见的消化系统恶性肿瘤。外科手术是目前治疗胰腺癌最好的手段，但由于早期诊断困难，90%的患者确诊时已是晚期，手术切除率较低，且易复发。化疗是治疗胰腺癌尤其是晚期胰腺癌的重要手段，吉西他滨是晚期胰腺癌化疗的首选药物，但在临床应用中疗效有限，根治术后辅助用药的中位生存时间仅为22.1个月；且近些年临床研究显示吉西他滨仅对12%的进展期胰腺癌患者有效［3］。联合治疗在一定程度上改善了晚期胰腺癌的疗效，但仍不够理想，晚期胰腺癌患者的中位生存时间仍仅有6.5～9.4个月［4］，其主要原因是化疗耐药性的产生，吉西他滨可使多数胰腺癌逐步耐药。

大黄素作为天然的化疗辅助药物，其能抑制多种恶性肿瘤细胞生长，也可以协同增强紫杉醇、吉西他滨等化疗药物的抗肿瘤作用；据有关报道，大黄素可以增强Her-2/neu过表达肺癌细胞对顺铂、阿霉素以及依托泊苷的敏感性［5］；还可以增强人食管癌细胞EC/CUHK1、人髓样白血病细胞NB4、U937对三氧化二砷的敏感性［6］。但大黄素是否有逆转胰腺癌细胞对化疗药物耐药作用的相关报道较少。本研究首先通过采用浓度梯度倍增法诱导建立耐药细胞株Bxpc-3/Gem。MTT法检测结果显示：不同浓度的大黄素对Bxpc-3/Gem和Bxpc-3细胞进行处理，结果表明大黄素对耐药细胞株Bxpc-3/Gem同样有抑制细胞增殖的作用，且具有浓度依赖性，与敏感株比较无明显差异；大黄素（40μm）联合吉西他滨处理Bxpc-3/Gem和Bxpc-3细胞，可以显著增强耐药细胞株对吉西他滨的敏感性，提高吉西他滨对Bxpc-3/Gem的增殖抑制作用。在此基础上，本课题进一步探讨了大黄素逆转胰腺癌耐药细胞株Bxpc-3/Gem耐药的可能分子机制。

NF-κB是一种普遍存在的核转录因子，与机体免疫、炎症反应、细胞增殖、肿瘤转移等有关。近些年报道，NF-κB与肿瘤化疗耐药的产生关系密切［7］。另有报道，可通过下调NF-κB的表达量和抑制其转录活性来抑制MDR1基因的表达，最终使P-gp的表达量和功能下降，从而达到逆转乳腺癌细胞系MCF-7的化疗耐药［8］。NF-κB除了可通过MDR1参与耐药的产生与进展外，还可以通过其它途径参与［9］。因此，NF-κB在肿瘤化疗耐药的形成中起着重要的作用，其可以通过多种机制参与肿瘤化疗耐药的形成。本研究运用RT-PCR方法从基因水平检测NF-κB，并用EMSA实验检测NF-κB的活性，发现大黄素组及联合吉西他滨组NF-κB的表达及活性明显降低。由此推测大黄素可通过下调NF-κB的表达及抑制其活性，参与逆转胰腺癌耐药细胞株对吉西他滨的耐药作用。

［1］ Li J,Liu PS,Mao HL,et al．Emodin sensitizes paclitaxel-resistant human ovarian cancer cells to paclitaxel-induced apoptosis in vitro．Oncol Rep,2009,21(6):1605-1610．

［2］ Chen H,Wei WT,Guo YF,et al．Enhanced effect of gemcitabine by emodin against pancreatic cancer in vivo via cytochrome Cregulated apoptosis．Oncol Rep,2011,25(5):1253-1261．

［3］ Bergman AM,Pinedo HM,Peters GJ．Determinants of resistance to 2'2'-difluorodeoxycytidine(gemcitabine)．Drug Resist Updat, 2002,5(1):19-33．

［4］ Burtness B,Thomas L,Sipples R,et al．PhaseⅡ trial of weekly docetaxel/irinotecan combination in advanced pancreatic cancer．Cancer J,2007,13(4):257-262．

［5］ Zhang L,Hung MC．Sensitization of HER-2/neu-overxpressing non-small cell lung cancer cells to chemotherapeutic drugs by tyrosine kinase inhibitor emodin．Oncogene,1996,12(3):571-576．

［6］ Yang J,Li H,Chen YY,et al．Anthraquinones sensitize tumor cells to arsenic cytotoxicity in vitro and in vivo via reactive oxygen species-mediated dual regulation of apoptosis．Free Radic Biol Med,2004,37(12):2027-2041．

［7］ Bentires Alj M,Barbu V,Fillet M,et al．NF-kappaB transcription factor induces drug resistance through MDR1 expression in cancer cells．Oncogene,2003,22(1):90-97．

［8］ Chen C,Shen HL,Yang J,et al．Preventing chemoresistance of human breast cancer cell line,MCF-7 with celecoxib．J Cancer Res Clin Oncol,2011,137(1):9-17．

［9］ Banerjee S,Wang Z,Kong D,et al．3,3'-Diindolylmethane enhances chemosensitivity of multiple chemotherapeutic agents in pancreatic cancer．Cancer Res,2009,69(13):5592-5600．