自拟强心汤对心梗后心力衰竭大鼠心肌舒缩功能的实验研究

高占义 魏月娟 王彦敏 李二娟 张 姗 王庆海

(1 河北医科大学附属沧州中西医结合临床学院心内科，沧州，061000； 2 河北医科大学附属沧州中西医结合临床学院超声科，沧州，061000； 3 河北医科大学附属沧州中西医结合临床学院科教科，沧州，061000)



自拟强心汤对心梗后心力衰竭大鼠心肌舒缩功能的实验研究

高占义1魏月娟1王彦敏2李二娟1张 姗1王庆海3

(1 河北医科大学附属沧州中西医结合临床学院心内科，沧州，061000； 2 河北医科大学附属沧州中西医结合临床学院超声科，沧州，061000； 3 河北医科大学附属沧州中西医结合临床学院科教科，沧州，061000)

目的：探讨自拟强心汤对心梗后心力衰竭大鼠心肌舒缩功能的作用机制。方法：采用结扎左冠状动脉法制备大鼠心梗后慢性心力衰竭动物模型；8周后，给予药物灌胃治疗；经治疗4周后，采用通过颈动脉插管测定大鼠血流动力学状态，通过实时荧光定量PCR(FQ-PCR)法和Western Bolt法检测心肌钙调控蛋白肌浆网钙泵(SERCA2a)、雷尼丁受体2(RYR2)mRNA水平及其蛋白表达量。结果：模型组大鼠的心功能显著下降，主要表现在血流动力学参数改变，其中左室舒张末期压(LVEDP)明显升高(P<0.01)，左室收缩压(LVSP)、左室上升最大速率(+LVdp/dtmax)及左室下降最大速率(-LVdp/dtmax)绝对值均降低(P<0.05)；心肌钙调控蛋白SERCA2a、RYR2 mRNA水平及其蛋白表达量均明显下降(P<0.05)。给予自拟强心汤干预后，能够有效的降低心力衰竭大鼠LVEDP水平(P<0.05)，升高LVSP、+LVdp/dtmax、-LVdp/dtmax水平(P<0.01)；能够升高心肌钙调控蛋白SERCA2a、RYR2 mRNA及其蛋白表达量的水平(P<0.05)。结论：自拟强心汤能够有效的改善心力衰竭大鼠的心功能，其机制可能与升高心肌钙调控蛋白SERCA2a、RYR2的蛋白表达量，改善钙循环有关。

自拟强心汤；慢性心力衰竭；心肌舒缩功能；血流动力学

自拟强心汤是由附子、白术、茯苓等温阳、利水中药组成的复方制剂，临证治疗心肾阳虚型心力衰竭病。RyR2是肌浆网上的钙离子释放通道，负责使Ca2+从肌质网中释放出来，促进Ca2+与肌钙蛋白C结合，使肌动蛋白和肌球蛋白结合，形成横桥，启动心肌收缩[1]；SERCA2a为肌浆网钙泵，负责将胞质内大部分Ca2+回摄入肌浆网内并储存，使Ca2+浓度迅速下降，并与肌钙蛋白C解离，横桥解除，使心肌细胞舒张[2]。二者分别负责Ca2+的释放和摄取，进而保证正常的钙循环，而钙循环的紊乱可导致心肌舒缩功能的障碍。本实验旨在研究自拟强心汤对心力衰竭大鼠心肌钙调控蛋白SERCA2a、RyR2含量的影响，进而探讨自拟强心汤改善心梗后心力衰竭大鼠心肌舒缩功能的作用机制及干预环节。

1 材料与方法

1.1 动物 正常雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，体质量(200±10)g，清洁级。

1.2 药物与试剂 自拟强心汤由附子、白术、茯苓等11味中药组成，均由沧州中西医结合医院提供，并于此院中药房完成制剂；缬沙坦胶囊(代文)由施维雅(天津)制药有限公司生产；PCR试剂盒；cDNA合成试剂盒；BCA蛋白质定量试剂盒；

1.3 仪器 PowerLab/4SP生物信号处理分析系统(澳大利亚ADI公司生产)；MLT1050/D型高精度压力换能器(澳大利亚ADI公司生产)；Chart v 5.0记录和分析软件(澳大利亚ADI公司生产)；ALC-V8S小动物呼吸机(奥尔科特科技生物有限公司生产)。

1.4 分组与给药 将清洁级SD大鼠常规饲料饲养，自由饮水。适应性饲养1周后，按照完全随机分为假手术组10只，模型组、缬沙坦组、自拟强心汤组各18只。对除假手术组外的其他各组行左冠脉结扎术，10只假手术组动物除穿线不结扎外，其余操作同模型组。术后8周开始灌胃给药，根据“实验动物与人按体表面积等效量换算比率”折算[3]，模型组和对照组予同体积的蒸馏水灌胃；缬沙坦组予代文悬浊液灌胃，给药剂量为8 mg/kg；自拟强心汤组予自拟强心汤水溶液灌胃，给药剂量为0.9 g/kg。连续给药4周，给药1次/d。

1.5 大鼠模型制作 根据徐淑云[3]的《药理实验方法学》采用冠状动脉结扎法(LAD)制备大鼠慢性心力衰竭模型，将雄性SD大鼠喂养一周，术前禁食12 h，用3%的戊巴比妥钠行腹腔麻醉，按照每公斤35 mg注射，麻醉好后将大鼠于手术台上固定，于手术部位备皮，经口气管插管，连接呼吸机保证呼吸功能，在大鼠四肢皮下连接心电监护。沿左侧胸前第3、4肋间部位将皮肤切开并逐层分离，打开胸腔，沿肋间切开，向上推开胸腺，扯开胸膜及心包膜，找到左心耳，在左心耳下方2～3 mm处用5.0号丝线穿过左冠状动脉前降支进行结扎。结扎后左室壁的颜色由红变白，同时会出现心室壁运动减弱等表现。同时，心电监护显示II导联R波振幅明显升高，随后出现的ST段亦明显抬高，证实结扎手术成功。待稳定后，关闭胸腔并逐层缝合。对照组大鼠穿线后不行结扎术，术后均用青霉素(40万U/只)连续抗感染治疗2 d[4]。

1.6 血流动力学的测定[5]在灌胃给药4周后，采用生物信号处理分析系统测定大鼠血流动力学，术前予禁食不禁水，称重后先用肝素钠抗凝30 min，按照每公斤体重1200 μ/kg注射，之后用戊巴比妥钠行腹腔麻醉。将麻醉好的大鼠仰卧固定于手术台上，从右侧颈部分离右侧颈总动脉，固定切口，用一根线结扎动脉远心端，在另一端插入心导管，通过生物信号处理和分析系统记录血流动力学参数；首先，将心导管在颈总动脉中观测心率，待心率稳定后，将心导管推入左心室，待稳定后，记录大鼠左心室收缩压(LVSP)、左室舒张末压(LVEDP)、左室压力上升和下降变化最大速度的参数值(±LVdp/dtmax)。

1.7 心肌钙调控蛋白SERCA2a、RYR2 mRNA表达及其蛋白相对表达量的测定 提取心肌组织，采用实时荧光定量FQ-PCR法检测SERCA2a、RYR2 mRNA水平，采用Western blotting法测定钙调控蛋白SERCA2a、RYR2的蛋白相对表达量(SERCA2a/GAPDH、RyR2/GAPDH)。

2 结果

2.1 血流动力学测定结果 与对照组相比，模型组大鼠LVEDP水平明显升高，LVSP水平明显降低(P<0.01)，+LVdp/dtmax及-LVdp/dtmax绝对值亦均降低(P<0.05)；提示心力衰竭时，大鼠心肌舒张和收缩功能减退。经治疗后，各用药组与模型组相比，缬沙坦组能降低心力衰竭大鼠LVEDP水平(P<0.05)，升高+LVdp/dtmax及-LVdp/dtmax水平(P<0.01)；自拟强心汤组能降低心力衰竭大鼠LVEDP水平(P<0.05)，升高LVSP、+LVdp/dtmax水平(P<0.01)，亦能升高大鼠-LVdp/dtmax水平(P<0.05)。各组间心率差异无统计学意义。见表1、2。

2.2 各组大鼠心肌钙调控蛋白SERCA2a、RYR2 mRNA的测定 采用FQ-PCR法检测心肌钙调控蛋白SERCA2a、RYR2 mRNA的相对表达量(SERCA2a/GAPDH、RyR2/GAPDH)。结果显示：与对照组比较，模型组大鼠心肌钙调控蛋白SERCA2a、RYR2 mRNA的表达量均下降(P<0.01)，提示心力衰竭时心肌舒缩功能下降。经治疗后，与模型组比较，仅有自拟强心汤组心肌钙调蛋白SERCA2a和RYR2 mRNA水平均升高(P<0.05)；而缬沙坦组的差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表1 各组大鼠心率及左室内压测定结果

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，◆P<0.05，◆◆P<0.01。

表2 各组大鼠+LVdp/dtmax测定结果

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，◆P<0.05，◆◆P<0.01。

表3 各组大鼠SERCA2a、RYR2 mRNA的测定结果

注：与对照组比较，**P<0.01；与模型组比较，◆P<0.05，◆◆P<0.01。

表4 各组大鼠SERCA2a、RYR2蛋白相对表达量的测定结果

注：与对照组比较，**P<0.01；与模型组比较，◆P<0.05，◆◆P<0.01。

2.3 各组大鼠心肌钙调控蛋白SERCA2a、RYR2蛋白相对表达量的测定 与空白对照组比较，模型组大鼠心肌钙调控蛋白SERCA2a、RYR2蛋白相对表达量均下降(P<0.01)，提示心力衰竭时心肌舒缩功能下降。经治疗后，与模型组比较，仅有自拟强心汤组心肌钙调蛋白SERCA2a、RYR2蛋白相对表达量水平升高(P<0.05)；而缬沙坦组的差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

3 讨论

心力衰竭是最常见的心血管疾病之一，心功能的异常体现在舒张与收缩功能2个方面，在导致心肌舒缩功能异常的众多因素中，心肌兴奋收缩耦联障碍占有重要地位，其中，钙循环的异常是导致兴奋收缩耦联障碍发生的重要原因之一[6]。研究显示，心肌细胞的舒张功能与胞质内Ca2+清除相关，胞质内Ca2+消除主要是经SERCA2a再摄取[7]，心肌细胞收缩性的强弱是由胞质内LTCC、RyR2的状态以及肌浆网钙含量等因素决定[8]。总之，肌浆网中钙离子循环是心肌收缩和舒张的重要环节，而钙循环包括钙回摄、钙释放及钙储存3个过程，任一过程的异常都将导致心肌细胞内钙稳态的破坏，这种破坏是心力衰竭心肌细胞舒缩功能下降的主要原因[9]。

目前强心药物的主要作用机制是通过增加Ca2+的浓度来增加心肌收缩力。而研究表明长期使用会产生钙超载现象，早期心肌细胞内Ca2+浓度的升高，使心肌收缩力的加强，但是Ca2+的持续增高使Ca2+与肌钙蛋白解离过程发生障碍，造成心肌舒张功能的异常[10]。再者，Ca2+急骤增多能够诱发持久而严重的肌丝挛缩，形成收缩带甚至发生肌丝断裂；在其过程中会消耗大量等能量物质，最终导致细肌丝横桥摆动无力，进而阻碍心肌收缩[11]。此外，钙循环的异还可激活由Ca2+为上游的信号分子，如蛋白激酶、钙调神经磷酸酶等，而这些信号分子能诱导心肌细胞肥厚和细胞死亡，最终导致心肌重构，此为发生心力衰竭的最基本机制[12]。新型的强心药即钙离子敏感药(如左西孟旦)，是通过增加肌钙蛋白对Ca2+的敏感性而增加心肌收缩力。其过程不增加细胞内Ca2+浓度，所以不会引起Ca2+超载所致的心律失常的问题，也不需要增强Ca2+转运时的能量消耗，不良反应较少[13]。目前，许多临床试验已证实了左西孟旦的安全性和有效性，短期使用可以明显改善心力衰竭症状，但是对长期生存率的影响还有待进一步研究，而且亦没有提示改善心室重构的问题。因此，本实验从中医药角度探讨中医中药改善钙循环，进而改善心肌舒缩功能的作用机制。

本实验结果显示，与空白对照组比较，模型组大鼠心肌钙调控蛋SERCA2a的相对表达量下降，提示心力衰竭时大鼠钙回摄能力减弱，影响了胞质内的钙清除，使舒张功能受损；RyR2 mRNA及其蛋白表达亦下降，影响了钙释放，导致钙储存量减少，影响了心肌细胞的收缩，2者共同导致心肌兴奋收缩耦联过程障碍，导致心肌舒缩功能的下降。研究中血流动力学参数也发生改变，心力衰竭大鼠LVEDP水平上升、-dp/dt max水平的下降，可反映心肌舒张功能的减退；LVSP、+LVdp/dtmax的下降可反映心肌收缩功能的障碍；与前者相符。从中医角度说明，在心力衰竭时，因心气推动无力，导致心输出量、心肌收缩力和心室顺应性明显下降，进而舒缩功能减退。经治疗后，采用温补心肾法可以增加SERCA2a、RyR2 mRNA及其蛋白表达量，增加钙回摄、钙释放能力，提高心肌细胞的收缩和舒张速率，改善钙循环，进而改善心肌舒缩功能。血流动力学测定结果亦显示，采用温补心肾法亦能降低LVEDP水平，升高-LVdp/dtmax、LVSP、+LVdp/dtmax水平，进而改善心肌舒缩功能。

近年来，在治疗CHF的治法中，90%左右采用益气温阳、活血利水之法，临床效果显著[14-15]。自拟强心汤是通过采用温补心肾，温阳利水的方法改善心肌SERCA2a、RyR2的表达，进而改善钙循环。其治疗方式不是单纯以增加心肌细胞内钙离子浓度为目的，而是通过改善心肌细胞的舒张和收缩速率，进而改善心功能，为临床治疗提供新的思路。

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(2016-01-14收稿 责任编辑：张文婷)

Study on myocardial systolic and diastolic function of Qiangxin Tang on heart failure after myocardial infarction in rats

Gao Zhanyi1，Wei Yuejuan1,Wang Yanmin2,Li Erjuan1,Zhang Shan1,Wang Qinghai3

(1DepartmentofCardiology,CangzhouintegratedtraditionalChineseandWesternMedicineClinicalCollege,HebeiMedicalUniversity,Cangzhou061000,China; 2Departmentofultrasound,CangzhouintegratedtraditionalChinesemedicineandWesternmedicine,HebeiMedicalUniversity,Cangzhou061000,China; 3HebeiMedicalUniversityaffiliatedCangzhouintegratedtraditionalChineseandWesternMedicineCollegeofscienceandeducation,Cangzhou061000,China)

Objective:To clarify myocardial systolic and diastolic function and possible mechanism of Qiangxin Tang on the model of heart failure.Methods:Model of heart failure after myocardial infarction was prepared by left coronary artery ligation.After 8 weeks，take a lavage treatment every day；After 4 weeks of continuous administration，cardiac hemodynamics parameters were recorded and SERCA2a，RYR2 mRNA level were detected by PCR(FQ-PCR)and SERCA2a，RYR2 protein expression were detected by Western bolt.Results:compared with control group，cardiac function of model group is lower：hemodynamic parameters LVEDP is increased obviously(P<0.01),LVSP，+LVdp/dtmax and-LVdp/dtmax absolute values were all lower(P<0.05)，and the calmodulin SERCA2a and RYR2 mRNA and protein relative expression of model group rats was decreased(P<0.05).Compared with model group，Qiangxin Tang group could reduce LVEDP levels(P<0.05),increase LVSP，+LVdp/dtmax and-LVdp/dtmax levels(P<0.01),and the calmodulin SERCA2a and RYR2 mRNA and protein relative expression of Qiangxin Tang were higher.Conclusion:Qiangxin Tang can effectively improves cardiac function in heart failure rats; Its mechanism is related with improving calmodulin SERCA2a、RYR2 and improving calcium cycle.

Qiangxin Tang；Chronic Heart Failure；Myocardial systolic and diastolic function；hemodynamic

河北省中医药管理局“自拟强心汤调控CaN-NFAT信号通路干预慢性心力衰竭的临床研究”(编号：2015287)

高占义(1977.06—)，男，学士，主治医师，研究方向：主要从事心血管疾病的临床、科研、教学及介入治疗工作，Tel：(0317)2179083，E-mail:gaozhanyi1977@163.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.11.042