黑果腺肋花楸花色苷对人胃癌细胞SGC-7901作用的初步探究

李梦莎，王 化，朱良玉，周丽萍，张悦

（黑龙江省科学院自然与生态研究所湿地与生态保育国家地方联合工程实验室，哈尔滨150040）

黑果腺肋花楸花色苷对人胃癌细胞SGC-7901作用的初步探究

李梦莎，王 化，朱良玉，周丽萍*，张悦

（黑龙江省科学院自然与生态研究所湿地与生态保育国家地方联合工程实验室，哈尔滨150040）

以人胃癌细胞SGC-7901作为模型研究黑果腺肋花楸花色苷的抗肿瘤活性，通过MTT实验检测黑果腺肋花楸花色苷对细胞生长的抑制作用。MTT结果表明，不同浓度的黑果腺肋花楸花色苷处理SGC-7901细胞24h、48h、72h后，黑果腺肋花楸花色苷均可抑制肿瘤细胞的生长。当浓度在1mg/mL-8mg/mL范围内，两种花色苷组分均有明显的抑制效果。8mg/mL花色苷组分2处理72h抑制率最高达到49.49%。但是在低浓度（1mg/mL以下）给药后两种花色苷组分并没有明显的线性规律与变化趋势，说明花色苷的纯度与还原能力与肿瘤的抑制率并没有直接的关系，还需要进一步探究。

黑果腺肋花楸；花色苷；胃癌细胞SGC-7901

黑果腺肋花楸（Aornia mealnocarpa Elliot）为蔷薇科（Roseeeae）腺肋花楸属多年生叶灌木。该植物原产于美国东北部，波罗的海沿岸至太平洋沿岸均有广泛分布，是集食用、药用、绿化和观赏于一身的经济树种。黑果腺肋花楸果实不仅具有很好的风味和色泽，而且含有高浓度的花色苷等黄酮类化合物，均具有较强的抗氧化活性，其中花色苷是其主要的抗氧化成分[1-4]。

花色苷是一类广泛地存在植物中的水溶性天然色素，是糖与糖苷键结合的一类化合物，Nemanija[5]等对直肠癌细胞Caco-2与HT-29的研究表明，黑果腺肋花楸果汁提取物具有很强的抑制作用，同时，在体外消化模型中具有极强的抗氧化与抗癌作用。Malik等[6]研究了黑果腺肋花楸对人结肠癌细胞（HT-29）细胞周期的阻滞作用及作用机制，实验结果显示对该癌细胞的抑制作用是通过抑制其生长实现的，而非细胞毒作用。且花色苷的抗突变活性是通过其自由基清除作用和抑制前致突变物的活化酶而发挥作用的。有研究表明紫薯花色苷能促进人肝癌细胞HepG2的凋亡，且细胞的凋亡率随着花色苷的浓度增加而增大[7]。

近年来花色苷抗肿瘤的作用越来越受到人们的关注。有研究表明花色苷对人肿瘤细胞有杀伤作用，对多种癌细胞如乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、结肠癌细胞、肝癌细胞等都具有不同程度的抑制作用[8-10]。然而黑果腺肋花楸花色苷抑制人胃癌细胞SGC-7901增殖，诱导凋亡的机制尚不清楚，本实验以SGC-7901细胞为模型，采用MTT比色法，初步探究黑果腺肋花楸花色苷对SGC-7901细胞的抗肿瘤效应，为胃病的预防、治疗及功能食品开发提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

黑果腺肋花楸果实：采购自吉林省延吉市。

人胃癌细胞株SGC-7901由东北林业大学细胞实验室提供。

主要试剂：胰蛋白酶（天津市灏洋生物制品有限责任公司）；胚胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；DMEM培养基（Gibson公司）；二甲基亚砜（DMSO）（Amresco公司）；无水乙醇（天津市东丽区天大化学试剂厂）。

1.2 方法

1.2.1 黑果腺肋花楸花色苷的制备

取黑果腺肋花楸适量，依据李梦莎[11]的方法进行高效提取花色苷。合并提取液，旋转蒸发除去提取溶剂，经X-5大孔树脂纯化，挑选出两种体外抗氧化活性较高的花色苷组分（组分1、组分2），减压浓缩，真空冷冻干燥得到蓝靛果花色苷粉末，用培养基稀释到一定浓度，过0.22mm滤孔膜后用于细胞试验。

1.2.2 黑果腺肋花楸花色苷纯度的评价

取经纯化制备的黑果腺肋花楸花色苷各组分0.0100g（精确到0.0001g），用80%乙醇溶解后定容至于100mL的容量瓶中，pH试差法测定各组分中花色苷含量，根据公式计算制备的花色苷的纯度。

P(%)=(M1/M2)×100%

式中：P表示浆果花色苷纯度（%）；M1表示组分中花色苷含量（mg）；M2表示组分重量（mg）。

1.2.3 黑果腺肋花楸花色苷总还原力的测定

还原能力的测定选取Tsai等采用的铁氰化钾还原显色法。通过700nm波长下的吸光度值（A1-A0）来衡量各浓度浆果花色苷的还原能力，还原能力高低与吸光度值大小成正相关。以抗坏血酸作为阳性对照品。

1.2.4 细胞培养

人胃癌细胞株SGC-7901用含10%胎牛血清的DMEM作为细胞培养基，细胞株置于37℃的CO2培养箱中培养，取对数生长期的细胞进行试验。

1.2.5 细胞抑制率的测定

将两种癌细胞培养至对数期，经胰蛋白酶消化后，用培养基稀释成1×105个/mL。在96孔板的每孔中加入100μL的细胞悬液，置于37℃的CO2培养箱中培养24h。再取出孔板在每孔中加入设定好浓度的样品液，同时设不加样的为空白对照，培养24h。

培养时间到后，将每孔中加入10μLMTT（5mg/mL），置于37℃的CO2培养箱中培养4h。用移液枪移去清液，再加入150mL DMSO溶液，振荡10min使其充分溶解，用酶标仪测定OD值。并计算抑制率：细胞生长抑制率=（1-实验组OD/对照组OD）×100%

2 实验结果

2.1 黑果腺肋花楸花色苷纯度

通过对黑果腺肋花楸花色苷纯度进行分析，样品1和样品2的纯度分别达到了46.03%和56.77%（表1）。样品2的纯度高于样品1的纯度，但是二者差异比较显著（P＜0.05）。

2.2 黑果腺肋花楸花色苷的总还原能力分析

从图1可以得出，黑果腺肋花楸花色苷组分2的总还原能力最强，达到590/g。组分1与组分2的总还原能力均与同浓度的Vc的总还原力差异显著（P＜0.05）（图1）。这说明组分1和组分2的总还原力都高于Vc对照。

2.3 MTT法的检测结果

由图2可以看出，组分1对胃癌细胞SGC-7901有一定的抑制作用，但是当浓度小于1mg/mL的时候，抑制率不明显，随着样品质量浓度的增加，抑制率也随之升高。当浓度为8mg/mL的时候，抑制率最高，达到了39.87%。

在1、2、4、8mg/mL花色苷样品1作用SGC-7901细胞24h后，抑制了细胞生长，抑制率分别为19.54%、25.33%、30.21%、33.45%；在加药培养48h后，抑制率为27.01%、30.22%、32.36%、35.88%；加药72h后，抑制率最终达到28.93%、34.21%、35.05%、39.87%。

表1 浆果花色苷纯度

图1 黑果腺肋花楸花色苷总还原力比较

实验结果表明，黑果腺肋花楸花色苷组分1在浓度达到一定水平后（1mg/mL-8 mg/mL）可以有效抑制胃癌细胞SGC-7901细胞生长，其抑制作用随药物浓度的增大而增大，随着作用时间的延长而增大，显示出有明显的量效关系。

由图3可以看出，组分2对胃癌细胞SGC-7901有一定的抑制作用，抑制率随着浓度逐渐增加，呈现先下降再上升的趋势。当浓度为8mg/mL的时候，抑制率最高，达到了49.49%。

在1、2、4、8mg/mL花色苷样品2作用SGC-7901细胞24h后，抑制了细胞生长，抑制率分别为10.30%、32.01%、32.96%、44.22%；在加药培养48h后，抑制率为12.54%、34.63%、35.42%、46.18%；加药72h后，抑制率最终达到15.21%、38.16%、39.45%、49.49%。

实验结果表明，黑果腺肋花楸花色苷组分2抑制胃癌细胞SGC-7901制细胞生长，其抑制作用随药物浓度的增大而显示出先下降再上升的趋势，而当浓度达到0.25mg/mL以后，其抑制作用随药物浓度的增大而增大，随着作用时间的延长而增大。

综上，两种黑果腺肋花楸花色苷组分都可以有效的抑制癌细胞的增殖，并且当浓度在1mg/mL-8mg/mL范围内，两种花色苷组分均有明显的量效关系。

3 讨论

至今为止癌症一直是让人类难以攻克的疾病之一，也是人类最主要的死亡病因之一。目前常用来治疗恶性肿瘤的方法是外科手术、化学疗法和放射疗法。但是存在毒副作用，治疗不彻底，复发率高等弊端，此外还会出现耐药性[12-14]。因此从天然产物中寻找毒副作用小、作用显著的具有抗肿瘤作用的生物活性成分或者抗肿瘤辅助药物，成为现在抗肿瘤药物的发展战略和方向之一。

图2 黑果腺肋花楸花色苷组分1对癌细胞的抑制率

图3 黑果腺肋花楸花色苷组分2对癌细胞的抑制率

本研究应用MTT比色法研究黑果腺肋花楸花色苷对人胃癌细胞SGC-7901的作用进行了初探，结果表明，两种黑果腺肋花楸花色苷组分都可以有效的抑制癌细胞的增殖。实验中所用的黑果腺肋花楸花色苷组分2的纯度要高于组分1，同时，总还原能力也比组分1强。当浓度高于2mg/mL时，组分2在所有水平下的抑制率均高于组分1的抑制率，并且两种花色苷组分都显示出了明显的量效关系。但是在低浓度（1mg/mL以下）给药后两种花色苷组分并没有明显的线性规律与变化趋势，说明花色苷的纯度与还原能力与肿瘤的抑制率并没有直接的关系，还需要进一步探究。本研究结果为花色苷应用于新型抗肿瘤药物提供了理论依据，也为进一步开发利用黑果腺肋花楸资源奠定了重要基础。

[1]李梦莎，周丽萍，朱良玉，等.基于Web of Science黑果腺肋花楸研究信息情报学分析[J].国土与自然资源研究，2015（6）：16-18.

[2]陈妍竹，胡文忠，姜爱丽，等.黑果腺肋花楸功能作用及食品加工研究进展[J].食品工业科技，2016，37（9）.

[3]于雪，胡文忠，姜爱丽，等.黑果腺肋花楸营养物质与功效的研究进展[J].食品工业科技，2016，37（10）.

[4]李梦莎，王化，朱良玉，等.黑果腺肋花楸的研究现状及培育技术[C]//中国科协年会—森林培育技术创新与特色资源产业发展学术研讨会.2014.

[5]Stanisavljevi N,Samard i J,Jankovi T,et al.Antioxidant and antiproliferative activity of chokeberry juice phenolics during in vitro, simulated digestion in the presence of food matrix[J].Food Chemistry,2015,175(175):516-522.

[6]MALIK M,ZHAO C,SCHOENE N,et al.Anthocyanin-rich extract from AroniamelanocarpaE.Induces a cell cycle block in colon cancer but not normal colonic cells[J].Nutr Cancer,2013,46(2):186-196.

[7]曹东旭，董海叶，李妍，吕晓玲.紫薯花色苷对人肝癌HepG2的作用[J].天津科技大学学报，2011，26（2）：9-12.

[9]Murray M,Rushworth S A,Lyubov Zaitseva,et al.Attenuation of dexamethasone-induced cell death in multiple myeloma is mediated by miR-125b expression[J].Cell Cycle,2013,12(13):2144-2153.

[10]Zeng C W,Zhang X J,Lin K Y,et al.Camptothecin induces apoptosis in cancer cells via microRNA-125b-mediated mitochondrial pathways.[J].Molecular Pharmacology,2012,81(4):578-86.

[11]李梦莎.响应面法优化超声提取黑果腺肋花楸花色苷工艺的研究[J].中国酿造，2014，33（9）：129-133.

[12]梁蓓蓓，刘华钢.天然药物抗肿瘤作用的研究进展[J].中国肿瘤，2007，16（9）：705-708.

[13]黄文峰.天然产物抗肿瘤研究进展[J].中西医结合研究，2009，1（6）：326-328.

[14]季宇彬，李莹琳，辛国松，等.肿瘤细胞凋亡相关途径研究进展[J].广州化工，2016，44（20）.

Study on the Effects of Anthocyanin of Aronia on Human Gastric Cancer Cell SGC-7901

LI Meng-sha et al

(Institute of Natural Resources and Ecology,HAS.National and Provincial Joint Engineering Laboratory of Wetlands and Ecological Conservation,Harbin 150040,China)

The anti-tumor activity of Anthocyanin of Aronia to human Gastric cancer cells SGC-7901 was studied by MTT experiment which studied the inhibiting effect of Anthocyanin of Aronia on cell growth.The results of MTT experiment indicated that the Anthocyanin of Aronia of different concentrations which were treated for 24,48,72h can all restrain the growth of cancer cell.WhentheconcentrationsofAnthocyaninwerebetween 1mg/mL-8mg/mL,the two Anthocyanin components had obviously dose-effect relationships.The highest inhibition ratio was 49.49%, which is 8mg/mL of the component 2 of Anthocyanin after being treated on 72 hours.However,there was no obviously linear rules and variation trend in the two components of Anthocyanin when in the low concentrations(below 1mg/mL),which showed that the purity and reducing capacity of Anthocyanin were no directly relationships with inhibition ratio of tumor.

Aronia melanocarpa;Anthocyanin; Gastric Cancer Cell SGC-7901

R284

A

李梦莎（1986-），女，黑龙江哈尔滨人，助理研究员，硕士，从事植物天然产物提取及利用。

周丽萍（1976-），女，吉林延边人，副研究员，硕士，从事植物天然产物提取及利用。

（2016-11-03收稿S编辑）

1003-7853（2016）06-0090-03

黑龙江省科学院青年创新基金重点资助项目“黑果腺肋花楸花色苷分离纯化及抗癌活性初步研究”（ZRS201501）