酿酒酵母合成异源单萜类化合物的研究进展

孙明雪, 周景文

江南大学生物工程学院， 江苏 无锡 214122

酿酒酵母合成异源单萜类化合物的研究进展

孙明雪, 周景文*

江南大学生物工程学院， 江苏 无锡 214122

单萜类化合物在食品、医药和工业等领域有重要的应用，具有可观的经济价值。随着合成生物学的日益发展，利用微生物作为细胞工厂合成单萜类化合物成为时下的研究热点。酿酒酵母是真核生物表达的模式菌株，其甲羟戊酸途径为单萜类化合物的合成提供直接前体，因此在酿酒酵母中构建异源单萜类化合物合成途径有较大优势。本文介绍了酿酒酵母细胞中异源单萜类化合物合成途径的构建。从甲羟戊酸途径代谢通量调控机制和融合酶调控酶催化反应效率两方面概述了酿酒酵母异源合成单萜类化合物的研究进展。

酿酒酵母； 甲羟戊酸途径； 单萜类化合物； 代谢； 融合酶

萜类化合物是自然界中广泛存在的次级代谢产物，其种类多样且数量巨大，迄今人们已发现40 000多种[1]。其中单萜类化合物广泛应用在食品、医药和化妆品等工业领域，具有重要的经济价值[2, 3]。目前，单萜类化合物主要从自然资源中提取，产量低且成本高，易受自然因素和外部环境的影响。化学合成面临工序繁多且分离困难等一些问题，且该方法较难实现化学结构复杂及有特定亲和性和专一性的萜类化合物的合成[4]。因此，单萜类化合物的工业化生产需要更可取的合成方式。近年来，微生物细胞工厂的建立和发展，为单萜类化合物的异源合成提供可能性[5, 6]。酿酒酵母作为真核生物表达的模式菌株，常被用于表达动植物来源基因[7]。因此，酿酒酵母也被用作单萜类化合物异源合成的表达宿主。酿酒酵母自身不具有合成单萜类化合物的能力，但其甲羟戊酸代谢途径能够提供单萜类合成的前体物质,为单萜类化合物合成创造有利条件[8]。目前，酿酒酵母异源合成单萜类化合物产量仍然较低，对单萜类化合物代谢途径和调控机理的深入研究将进一步促进单萜类化合物的高效合成。

1 酿酒酵母单萜类化合物异源合成途径的构建

1.1 酿酒酵母甲羟戊酸合成途径

酿酒酵母甲羟戊酸(MVA)代谢途径(图1)首先由乙酰辅酶A(Acetyl-CoA)经缩合反应生成3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA (HMG-CoA)，然后在HMG-CoA还原酶(HMGR)的作用下由HMG-CoA合成MVA，MVA经焦磷酸化和脱羧作用生成异戊烯焦磷酸(IPP)，IPP在异构化酶的作用下生成二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)。DMAPP和IPP经过缩合反应形成香叶基二磷酸(GPP)，即合成单萜的前体；GPP又进一步与IPP结合，生成法尼基焦磷酸(FPP)，即合成倍半萜的前体；FPP再与另一个IPP缩合，形成香叶酰香叶基二磷酸(GGPP)，即合成二萜的前体。在多种酶催化作用下，以GPP、FPP、GGPP为前体，合成种类多样的类异戊二烯化合物。

1.2 单萜类化合物合成途径的构建

与植物细胞相比，酿酒酵母细胞内缺乏单萜类合成酶，因此不具有合成单萜类化合物的能力。为了实现酿酒酵母细胞表达异源单萜类化合物，需引入外源单萜合成酶。这些编码单萜类合成酶基因大多数来源于植物。1996年，Dudareva等从植物仙女扇中获得第一个单萜合成酶编码基因，主要负责合成芳樟醇合成酶(LIS)[9]。2010年，Chen等从植物猕猴桃(Actinidiaarguta,Actinidiapolygama)中分离得到两种单萜合成酶，AaLS1和ApLS1，合成(S)-芳樟醇[10]。

图1 酿酒酵母中甲羟戊酸代谢途径

目前，少数来源于植物的单萜合成酶已经实现在酿酒酵母中的表达。Oswald等在酿酒酵母中成功表达来源于山字山草(Clarkiabreweri)的芳樟醇合成酶和来源于甜罗勒(Ocimunbasilicum)的香叶醇合成酶，并通过代谢工程手段进一步提高了单萜芳樟醇和香叶醇合成能力[11]。2008年，Herrero等在野生型酿酒酵母的类异戊二烯生物合成途径上成功引入芳樟醇合成代谢支路，并且能够有效分泌芳樟醇[12]。表明利用酿酒酵母作为细胞工厂高效合成单萜类化合物有极大生产潜力。

2 调控酿酒酵母甲羟戊酸途径代谢通量

酿酒酵母甲羟戊酸代谢途径代谢通量较低，且调控机制复杂，很大程度影响单萜合成产量。为了增加甲羟戊酸途径的代谢通量，通过对诸多重要调控节点的控制，达到改变基因转录水平、mRNA的翻译、酶活及蛋白稳定性的目的，从而调节整个途径的代谢通量。

2.1 关键酶的调控机制

HMGR是甾醇合成途径中的限速酶，该酶催化HMG-CoA不可逆的生成MVA。在酿酒酵母中，HMGR有两种同工酶，Hmg1p蛋白比较稳定，Hmg2p蛋白则经过固醇合成途径降解[13]。受细胞调控机制影响，末端代谢产物的积累抑制HMGR的酶活，为了解除抑制作用，将HMGR的N末端膜锚定区域截断，单独表达具有催化作用的蛋白C末端(tHMGR)[14, 15]。Rico等在酿酒酵母中过量表达tHMG1，使单萜产量提高至原来的2倍[16]。Behrendorff等利用一株表达tHMG1基因的酿酒酵母合成柠檬烯，使其产量提高至1.5 mg/L[17]。刘继栋等过量表达tHMG1基因显著提高香叶醇产量[18]。表明HMGR是酿酒酵母甲羟戊酸途径上关键调控节点，tHMGR是该酶的调控形式，对增加甲羟戊酸途径代谢通量有显著作用。

异戊二烯焦磷酸异构酶(IDI1) 是控制所有萜类化合物合成的第一步，在IPP到DMAPP转化过程中能够调节IPP/DMAPP的存在比例[19, 20]。2011年，Ignea等为了增加萜类生产量，通过基因工程手段调控IDI1表达，最终提高单萜产量，并且维持菌株的稳健性。然后将IDI1与HMG2 (K6R)同时进行共表达，实现单萜合成最大产量[21]。2014年，Ignea等在酿酒酵母中过量表达IDI1，使桧烯产量提高3倍[22]。表明通过过量表达IDI1可以将平衡转向GPP合成有利的方向，增加前体物质积累，有利于单萜类物质的合成。

2.2 强化单萜合成前体物质GPP供给

在酿酒细胞中，法尼基焦磷酸合成酶(FPPS)首先将一分子DMAPP与一分子IPP进行缩合反应，形成GPP，然后GPP与一分子IPP进行缩合，生成FPP。GPP与FPP的合成共用一个由ERG20基因编码的FPPS，通常GPP与FPPS的催化位点紧密结合并直接转化为FPP，使游离存在的GPP含量极少，造成单萜合成前体物质供应不足，较大程度限制单萜类化合物的合成。

通过序列比对分析来源于不同生物体内的FPPS发现，在该酶的保守区域包含两段Asp-rich序列。第一个Asp-rich序列为DDXXD或DDXXXXD，主要通过催化反应绑定DMAPP，GPP，FPP。第二个序列DDXXD主要负责绑定IPP。研究表明，通过对FPPS保守区域特定位点进行定点突变，可以使GPP从FPPS上的结合位点释放，从而增加细胞内游离GPP含量[23]。Fischer等对酿酒酵母ERG20基因保守区域特定催化位点K197进行突变，并在该突变菌株内表达异源香叶醇合成酶，最终显著提高单萜香叶醇合成产量[24]。表明对ERG20基因的调控能够调整GPP和FPP的合成比例，使GPP合成量增加。

3 构建融合酶调控酶催化反应效率

3.1 融合酶的空间靠近效应

融合酶是指采用分子生物学手段，利用融合酶技术，将目标酶与另外一个或多个酶以一定的形式连接起来，从而获得的具有多种功能的酶[25]。通过融合酶的构建，可以将参与顺序酶催化过程的两个(或多个)酶催化活性整合在一个杂合蛋白上，从而实现多酶的空间靠近效应，改变酶分子的空间组织结构，进一步控制酶催化反应效率。

在合成代谢途径上，各个酶的空间位置结构对中间产物的流向起重要影响，特别是以下几种情况：中间产物有其他竞争反应；中间产物易失活；中间产物对细胞产生毒性或者对酶存在反馈抑制；其他非目的底物对酶有竞争[26, 27]。在多步代谢反应途径中，前体物质作为中间产物可能会扩散，被降解或者被其他竞争途径上的酶利用合成其他物质，中间产物的消耗会直接影响萜类化合物的合成效率。融合酶的空间靠近效应能够拉近合成途径中的两个(或多个)酶的空间距离，促进中间产物在两个酶催化活性位点的直接传递，减少中间产物的扩散和降解，同时防止中间产物被竞争利用，防止酶活性位点被其他非目的底物所占据，因此可以有效的提高产物的产量、产率和底物的转化率[28, 29]。

3.2 构建融合酶

在酿酒酵母细胞中引入异源单萜合成酶，该酶能否在宿主细胞中正确表达受到各方面因素的影响，并且异源单萜合成酶需要利用宿主细胞自身的酶代谢系统合成的代谢中间体合成目标产物。当异源酶导入宿主细胞中，酶分子之间的距离难以控制，制约异源酶的催化效率[25]。

在酿酒酵母中，异源单萜合成酶利用前体物质GPP合成单萜类化合物，FPPS催化GPP的合成，因此将参与序列催化反应的单萜合成酶与FPPS连接，构建一个融合酶。在融合酶构建过程中，引入连接肽，将两个酶间距适当隔开，避免两酶不同结构域在折叠、催化过程中相互干扰[30, 31]。两酶结构域的N端和C端的连接方式同样会影响融合酶功能的表达。研究表明，融合表达LIS和FPPS，与单独表达LIS相比，融合表达使(S)-芳樟醇产量提高近70%[32]。说明多步代谢反应体系中，调节顺序酶活性中心的空间位置结构对底物的传递至关重要。

4 结论与展望

随着对单萜类代谢途径及其调控机制研究的深入，代谢工程成为实现酿酒酵母异源合成单萜类化合物最具潜力的方法之一[33, 34]。目前，很多研究已经通过代谢工程手段实现单萜类化合物在酿酒酵母中的异源合成。但合成产量普遍较低，要实现工业化生产还有很多工作需要完善。近年来合成生物学的快速发展，为利用微生物发酵生产单萜类化合物奠定了基础。

酿酒酵母甲羟戊酸途径提供单萜类化合物合成的直接前体物质，同时也为细胞提供必要的初级代谢产物，目前对该途径的代谢调控机制尚不完全清楚，限制了异源单萜类化合物代谢途径的构建。因此，对复杂调控和代谢网络的持续研究将会有利于宿主细胞代谢途径的重新设计和优化，相关代谢数据库的建立，产物合成途径的不断挖掘，从而获得高效微生物细胞工厂。更多基因组的开发和测序研究，将加速新化合物的发现。在微生物细胞中构建单萜类化合物合成途径过程中，异源单萜类合成酶能否在宿主细胞中正确表达有众多影响因素。因此，酶工程的发展也能够为异源合成途径的建立提供基础。综合利用以上方法，最终将会实现单萜类化合物在酿酒酵母中的工业化生产。

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Research advances of heterologous synthesis of monoterpenes in Saccharomyces cerevisiae

SUN Ming-xue， ZHOU Jing-wen

School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122 Jiangsu, China

Monoterpenes are widely used in food, medicine and industries, which have great economical values. With the development of synthetic biology, monoterpenes synthesis using microbial cell as factory have become a hot research topic.Saccharomycescerevisiaeis a model eukaryotic expression strain, mevalonate pathway provides precursors for the synthesis of monoterpenes, so it has great advantages to construct heterologous monoterpenes synthesis pathway. The construction of heterologous monoterpenes synthesis pathway inSaccharomycescerevisiaewas introduced. The research advances in heterologous expression of monoterpenes inSaccharomycescerevisiaewere reviewed from regulatory mechanisms of metabolic flux of mevalonate pathway and regulation of enzyme catalytic efficiency using fusion enzymes.

Saccharomycescerevisiae; mevalonate pathway; monoterpenes; metabolism; fusion enzymes

10.3969/j.issn.1001-6678.2016.06.009

国家自然科学基金重点项目(31130043)，国家自然科学基金(31000807)，江苏省自然科学基金重点项目(BK2011004)，江苏省自然科学基金(BK2010150)。

孙明雪(1987～)，女，硕士，助理实验师。Tel：0510-85918125，E-mail:mingxuesun@163.com。

*通信作者: 周景文(1982～)，男，博士，教授，博士生导师。Tel：0510-85918312，E-mail：zhoujw1982@jiangnan.edu.cn。