不同来源的木聚糖酶、甘露聚糖酶在猪和鸡肠道消化液中的稳定性研究

■ 苗华彪 韩楠玉 ，2，3，4 李国涛 唐湘华 ，2，3，4 黄遵锡 ，2，3，4*

(1.云南师范大学生命科学学院，云南昆明 650500；2.生物能源持续开发利用教育部工程研究中心，云南昆明 650500；3.云南省生物质能与环境生物技术重点实验室，云南昆明 650500；4.云南师范大学酶工程重点实验室，云南昆明 650500)

优良的酶制剂除了在饲料工业和养殖产业上有较大规模的应用，在节约粮食和环境的可持续发展方面也有突出的贡献。目前，酶制剂的开发与推广已经成为生物产业中的重要课题[1]。研究表明，外源酶制剂的添加不仅不会对畜禽内源性酶造成影响，还能加快营养物质的吸收和利用，并提高饲料原料的营养价值，达到降低饲料生产成本的目的[2-3]。添加到饲料中的酶制剂种类繁多，成功应用虽然具有一定难度，但也存在巨大的开发空间。在现有的饲料酶制剂中，木聚糖酶和甘露聚糖酶等非淀粉多糖酶制剂已得到广泛应用[3-5]。木聚糖酶可对饲料中的阿拉伯木聚糖进行有效的降解，以此消除饲料原料中抗营养因子的不利效应，从而提高原料的利用率。甘露聚糖酶可以降解多组分抗营养因子，提高动物的日增长率，改善畜禽肠道中微生物菌群[6-7]。如今，酶制剂在生猪养殖和家禽养殖中都有显著的促生长效果。因此，寻求一款稳定性高的酶制剂是生产厂家和消费者的共同诉求。众所周知，无论是木聚糖酶还是甘露聚糖酶都会受到温度、pH值、内源性消化酶和其它生物大分子等诸多因素的影响[8]。不同酶制剂有不同的最适pH值环境和最适温度，当它们在各自的最适环境中能够发挥最大的催化活力。就实际情况分析：家畜和家禽消化道的正常温度约为40℃，猪胃部环境的pH值环境在2.5～3.5间，小肠pH值环境在5.0～7.0间，大肠酸碱度呈中性[9]。本研究中的木聚糖酶和甘露聚糖酶这类非淀粉多糖酶的最适pH值为5.0～7.0，主要在猪小肠液和鸡消化液中发挥作用[10]。至今鲜有酶制剂在真实环境中（例如猪和家禽的消化液中）耐受情况的报道，体外的简单环境（pH值、温度）模拟试验并不能充分揭露畜禽消化道对酶制剂的真实作用。因此，我们选用猪的肠液和鸡消化液耐受木聚糖酶和甘露聚糖酶，以此来研究、比较不同酶制剂在畜禽消化道中的稳定性。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验选中的八种不同酶制剂是选自全国各地市场在售的产品，其酶活性见表1。消化液取自市场流动的生猪和菜鸡（昆明）。

1.2 主要的试验试剂和仪器

木聚糖（Xylan from beechwood＞98%）、角豆胶(Locust bean gum from Ceratonia siliqua seeds＞98%)均购自美国Sigma公司；分析天平购自梅特勒-托利多仪器有限公司；紫外分光光度计购自德国Analytic Jena公司；酶标仪购自Bio-Rad公司；离心机购于德国Ep⁃pendorf公司；恒温水浴锅等其他仪器均为国产。

表1 8种不同来源的酶制剂的命名及酶活（U/g）

1.3 猪的小肠液和鸡的消化液（现用现取）

猪的小肠液取自昆明市呈贡区屠宰场，取刚刚屠宰过的生猪的小肠液500 ml立即置于冰上，然后低温离心取上清液并测定其pH值，上清液用作处理酶制剂。购买活鸡屠宰，取其肠内消化液离心去杂质并测定其pH值，上清液用作酶制剂处理。

1.4 酶活的测定方法

根据3,5-二硝基水杨酸(3,5-Dinitrosalicylic acid，DNS)酶活测定法：加入0.1 mol/l、pH值5.5的柠檬酸缓冲液450 ml和相同体积1%的底物，于37℃水浴锅中预热5 min，加入0.1 ml待测酶液，混匀反应10 min，然后加入1.5 ml DNS停止反应，摇匀后煮沸5 min，冷却后于540 nm波长测定吸光度值[11]。

1.5 试验方法

准确称取一定量的四种木聚糖酶和四种甘露聚糖酶酶制剂颗粒到pH值5.5、浓度0.1 mol/l的柠檬酸-磷酸缓冲液中，放在磁力搅拌器上搅拌30 min，取0.5 ml溶解的酶液分别与9.5 ml现取猪肠液或鸡消化液充分混合。取适量混合液在37℃处理0～5 h，以没有处理的酶液为对照。取样经适当稀释后在37℃、pH值5.5下按照DNS法测定其酶活，以未经处理的酶液为100%。

1.6 试验方法

木聚糖酶和甘露聚糖酶的最适pH值：将适当稀释的八种酶制剂分别于37℃下，pH值为3.0～10.0范围环境内进行酶促反应；木聚糖酶和甘露聚糖酶的最适温度：将适当稀释的八种酶制剂分别于pH值5.5环境下，于30～80℃范围内进行酶促反应。

2 试验结果

2.1 4种木聚糖酶和4种甘露聚糖酶的最适温度

木聚糖酶、甘露聚糖酶各4种最适温度结果见图1。本试验所选择的木聚糖酶和甘露聚糖酶最适温度分布在50～65℃，其中4种木聚糖酶最适温度分别为：65、60、55℃以及 65℃；4种甘露聚糖酶最适温度前三种为60℃，4号甘露聚糖酶为50℃。并且8种酶制剂都具有较宽的温度范围。

图1 四种木聚糖酶和甘露聚糖酶的最适温度

2.2 4种木聚糖酶和4种甘露聚糖酶的最适pH值

木聚糖酶、甘露聚糖酶各4种的最适pH值结果见图2。所选用的木聚糖酶和甘露聚糖酶的最适pH值分布在5.0～6.0，为中性偏酸酶制剂，并且在pH值4.0～8.0时具有良好的pH稳定性。

2.3 猪的小肠液对木聚糖酶和甘露聚糖酶酶活的影响

图2 四种木聚糖酶和甘露聚糖酶的最适pH值

猪的小肠液对木聚糖酶、甘露聚糖酶最长耐受4 h结果见图3。四种木聚糖酶在37℃处理4 h后相对酶活剩余均在48%～60%之间，相对而言其中2号木聚糖酶的稳定性最好，4 h耐受后剩余酶活仍接近60%，3号木聚糖酶和4号木聚糖酶次之，4 h后分别剩余55%和53%的酶活，而1号木聚糖酶耐受相对效果最差，4 h后已降到50%以下，仅剩余48%的酶活。类似的，四种甘露聚糖酶在37℃处理4 h后，2号甘露聚糖酶稳定性最好，剩余65%的酶活；4号甘露聚糖酶表现最差，相对剩余酶活仅为10%；而1号和3号甘露聚糖酶4 h后相对剩余酶活分别为48%和58%。

2.4 鸡的消化液对木聚糖酶、甘露聚糖酶酶活的影响

鸡消化液对木聚糖酶和甘露聚糖酶的耐受结果见图4，在37℃耐受5 h后两类酶制剂的所有产品的相对剩余酶活都在50%以上。其中：1号木聚糖酶稳定性效果最差，耐受5 h后，相对剩余酶活为63%；2号木聚糖酶稳定性最好，相对剩余酶活为76%；3、4号次之相对剩余酶活分别为68%和75%。四种甘露聚糖酶在鸡消化液中稳定性表现为：4号甘露聚糖酶稳定性最差，耐受5 h后相对剩余酶活为52%；2号稳定性最好，5 h后相对剩余酶活为67%；1、3号次之，5 h后其相对剩余酶活分别为56%和65%。

图3 4 h内猪小肠液对四种木聚糖酶和甘露聚糖酶酶活的影响（37℃）

图4 5 h内鸡消化液对四种木聚糖酶和甘露聚糖酶酶活的影响（37℃）

3 讨论

饲用酶制剂作为一种生物催化活性蛋白，具有酶的所有特征。虽然具较高活性，然而在不同的畜禽体内环境中，活性也会受到pH值、温度以及体内外其它离子和蛋白的影响[12]。只有当酶制剂的酶学性质（如最适温度、最适pH值以及体外环境等）与动物胃肠道生理特点相吻合时，才能充分发挥其催化活性，催化效率才能达到最大[13]。一般来讲，胃肠道中酶解作用的环境条件（如pH值、底物浓度及内源性蛋白酶等）均不断发生变化，猪胃液呈偏酸性环境，而后段肠液呈偏中性的环境；鸡的消化液的环境介于pH值4～7之间，呈酸性[14-15]。同理，酶制剂受温度的影响也比较大，选择适宜的测定温度也是必要的。在选择体外评估酶制剂的生物学功效时，其所选的处理温度应接近动物的体温37～42℃，因此，本试验选择在37℃的温度条件下进行。

猪小肠液和鸡消化液环境相对胃液pH值有着明显升高可到6.0～7.0左右，并且具有大量的内源性蛋白酶（胰蛋白酶、糜蛋白酶等酶）以及胆汁[16]。而大多数木聚糖酶和甘露聚糖酶其最适pH值介于微酸附近，肠液的酸碱环境刚好适合木聚糖酶和甘露聚糖酶的发挥，因此本试验选用肠液作为稳定性研究对象。两类酶制剂的稳定性在猪小肠液处理4 h后，相对剩余酶活具有很大差距：四种不同来源的木聚糖酶有40%～52%的下降；四种甘露聚糖酶有着35%～90%不等的下降。两类酶制剂在鸡消化液中处理5 h后，木聚糖酶的相对剩余酶活有24%～37%的下降，四种甘露聚糖酶有33%～48%不同程度的下降。肠道作为一个复杂的生物催化的场所，有各种因素影响酶促反应。本研究所选用的猪小肠液和鸡消化液环境的pH值分别为6.6和6.4，温度为37℃，虽与两类酶制剂的最适pH值环境及最适温度接近，然而其它的复杂生物因子仍然影响着酶制剂的酶活，例如内源蛋白酶和胆汁液等对所选酶制剂的分解作用使其酶活力下降[17]。因此，在此真实的消化液环境条件下耐受4 h和5 h后甘露聚糖酶和木聚糖酶的酶活有所下降是必然的；而不同种类的酶制剂受环境的影响也有差别，在本试验中发现甘露聚糖酶制剂相比于木聚糖类酶制剂的耐受效果要差一些。

另一方面，对于来源相同的酶制剂在猪和鸡两种动物消化液的稳定性结果也不尽相同，相同来源的酶制剂的稳定性结果展现为：无论木聚糖酶还是甘露聚糖酶，在鸡肠道消化液中稳定性要好于在猪肠道小肠液。分析其可能原因为，不同种属动物及其发育成熟过程中，肠道黏膜细胞膜表面蛋白质所含糖链及糖基化模式有所不同，鸟类较猪代谢和消化较快，与肠道消化液中化学性消化较弱有关[18]。同时本研究还表明不同来源的酶制剂在猪和鸡肠道内的稳定性与酶活力并无直接关联，无论木聚糖酶还是甘露聚糖酶在猪小肠液或者鸡肠道消化液中的稳定性和生产酶活不成正比关系。

猪小肠液和鸡消化液中环境的变化，严重影响了酶制剂的活性，不同厂家之间也会有着一定的差异。在本试验中，不论在猪小肠液或鸡的肠道消化液中：四种木聚糖酶制剂，2号耐受效果最好，1号最差，3号、4号次之；四种甘露聚糖酶制剂，2号耐受效果最好，4号最差，1号、3号次之。因此，我们选用酶制剂时，要选用在实际畜禽胃肠液中耐受效果好、保留时间长、相对剩余酶活高的酶制剂。确保酶制剂在畜禽消化道中能够真正发挥其生物学功效，使底物有效的降解，改善畜禽对外来营养物质的消化与吸收，这样才能更好的发挥酶制剂的作用，带来更高的效益。

4 结论

在猪小肠液和鸡肠道消化液中稳定性最好的木聚糖酶和甘露聚糖酶分别是2号木聚糖酶、2号甘露聚糖酶，最差的是1号木聚糖酶和4号甘露聚糖酶。不同来源的酶制剂在猪小肠液和鸡肠道消化液的稳定性具有一致性，相对于猪小肠液，酶制剂在鸡肠道消化液中更加稳定。同时，酶制剂在畜禽肠道消化液中稳定性和生产酶活力并不成正比关系。