活血化瘀中药对糖尿病肾病大鼠肾脏保护及血清降钙素基因相关肽的影响

郑君芙

(天津市滨海新区中医医院内一科，天津 300451)

活血化瘀中药对糖尿病肾病大鼠肾脏保护及血清降钙素基因相关肽的影响

郑君芙

(天津市滨海新区中医医院内一科，天津 300451)

目的 研究活血化瘀中药对糖尿病肾病大鼠肾脏保护及血清降钙素基因相关肽(CGRP)的影响。方法 SD大鼠分为正常组(n=16)、模型组(n=16)、中药组(n=16)，模型组和中药组利用单侧肾切除加腹腔注射链脲佐菌素(STZ)造成糖尿病肾病大鼠模型。正常组和模型组灌服等容积蒸馏水。中药组在单肾切除STZ诱导糖尿病肾病模型成模后灌胃活血化瘀中药。第8、12周末分2批检测24 h尿蛋白定量(24 hUTP)、血糖(Glu)、血尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)及体质量的变化，放射免疫法测定CGRP。结果 第8、12周末模型组24 hUTP、Glu、体质量与正常组比较差异均有统计学意义(P<0.05)；第8、12周末中药组24 hUTP与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)；第8、12周末中药组Glu与模型组相比有下降趋势，但无统计学意义(P>0.05)；第8、12周末中药组体质量与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)；第12周与第8周相比，中药组体质量有上升趋势，差异有统计学意义(P<0.05)。第8、12周末模型组BUN与正常组同期比较差异有统计学意义(P<0.05)；第12周末中药组BUN与模型组相比有下降趋势，第12周与第8周相比中药组下降，差异有统计学意义(P<0.05)；随着造模时间的延长，模型组血Cr含量比正常组稍有增加，但无统计学意义(P>0.05)，第12周末中药组与模型组相比有下降趋势，无统计学意义(P>0.05)；第8、12周末模型组和中药组的CGRP升高，与正常组同期比较差异均有统计学意义(P<0.05)，且中药组CGRP与模型组同期比较差异有统计学意义(P<0.05)，第12周与第8周中药组CGRP比较升高，差异有统计学意义(P<0.05)。结论 活血化瘀中药对单肾切除STZ诱导糖尿病肾病大鼠有降低蛋白尿，调节血糖代谢，保护肾功能的作用。活血化瘀中药对单肾切除STZ诱导糖尿病肾病大鼠能明显扩张肾脏血管，增加肾脏血流量，改善肾脏血液微循环，有效提高肾脏滤过率，减轻肾脏病理损害，从而达到保护肾功能的作用。

糖尿病, 实验性；糖尿病肾病；中药疗法；大鼠；动物

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)属糖尿病微血管病变范畴,是一种临床常见的继发性肾脏病,据统计DN占糖尿病患者死亡率的60%[1],糖尿病患者死于DN肾衰竭者为非糖尿病患者的17倍[2]。DN的病理变化主要是肾小球硬化和肾小管坏死。现代医家普遍认为DN存在血液高凝状态，瘀血内阻是导致DN发生、发展的重要因素[3]。认为血瘀存在于疾病发展的始终，活血化瘀治则应该贯穿于治疗的始末。降钙素基因相关肽(CGRP)是目前已知体内最强的舒血管多肽, 肾血管床中存在丰富的CGRP受体,CGRP通过与这些受体结合而产生强大的舒张肾血管作用。因此，我们建立DN大鼠模型，用药物干预的方法，通过探讨活血化瘀中药对DN大鼠肾脏保护及CGRP的影响，为活血化瘀中药用于临床治疗DN提供客观依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物、试剂与仪器 Sprague-Dawleg(SD)系雄性大白鼠60只，体质量(200±20)g，SPF/ VAF级，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。链脲佐菌素(STZ)(Sigma公司产品，北京莱博生物实验材料研究所分装)，临用前用0.1 mmol/L枸橼酸缓冲液，pH 4.2，4 ℃配成2%溶液。美国强生稳灵型血糖仪SmartScan。活血化瘀中药由丹参30 g、鬼箭羽30 g组成，药物购自天津中医药大学附属保康医院中药房，按比例称取后加水浓煎提取至2.5 g生药/mL的浓度，备用(由天津中一制药厂提供)。SYNCHRON CX-7全自动生化分析仪。CGRP放免试剂盒，由天津九鼎医学生物工程有限公司提供。

1.2 造模方法 给予普通饲料、自由饮水，适应性饲养1周后按体质量随机分为正常组(18只)、造模组(模型组、中药组共42只)。造模组参照1978年Steffes MW[4]等报道的造模方法加以改进。以10%水合氯醛3.5 mL/kg腹腔注射麻醉，行左肾摘除术。方法：常规背部消毒，背部切口1～1.5 cm，暴露左肾，剥离肾脏脂肪及肾上腺，结扎左肾门血管，切除左肾，缝合切口。术后1周，按45 mg/kg体质量腹腔内注射STZ，临用前用0. 1 mmol/L枸橼酸缓冲液，pH 4.2，4 ℃配成2%溶液，72 h后尾静脉取血测血糖(Glu)(用美国强生稳灵型血糖仪SmartScan)，Glu>16.7 mmol/L者确定为糖尿病模型制作成功(2只大鼠未成模被排除)。剩余大鼠按Glu随机分为模型组和中药组。中药组造模成功第1 d开始给药，大鼠给药剂量按药理学实验动物给药方法(马氏定理)计算，均以成人剂量/kg的15倍[20 g/kg·d]灌胃。正常组和模型组灌服等容积蒸馏水。各组每日灌胃1次，直至8周和12周处死。各组大鼠分笼喂养于天津中医药大学动物实验室,每笼4～5只,自由饮水,以大鼠维持饲料饲养。

1.3 标本收集 于第8周(每组各8只)、12周(每组各8只)末实验结束前2 d将大鼠置于清洁的代谢笼中，收集24 h尿液，量取尿量，尿标本离心后测24 h尿蛋白定量(24 hUTP)；股动脉取血，分离血清测量Glu、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)；股动脉取血3 mL，注入含7.5%乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2) 40 μL 和抑肽酶40 μL的试管里，混匀，4 ℃ 3 600 r/min离心10 min后分离血清，放入-20 ℃保存备用(测定CGRP)。

1.4 检测指标和方法 动物处死前称量体质量；尿标本离心后测24 hUTP，Glu、BUN、Cr、TG、TC用全自动生化分析仪测定。

CGRP测定应用放射免疫法，步骤：将冰冻保存的血清样本在冷水中复融混匀，再次4 ℃ 3 600 r/min离心10 min，取上清200 μL检测，在r计数器上测定cmp数,根据标准管结果在半对数坐标纸上作出标准曲线,并查出样品值。

2 结 果

2.1 一般情况观察 正常组大鼠反应敏捷，活动正常，毛色光泽，饮食、饮水正常，大便呈颗粒状，尿色淡黄；模型组和中药组大鼠活动减少，反应迟钝，毛发灰黯欠光泽，多饮多食，消瘦，尿量增多，大便稀溏等。但8周后，中药组大鼠状态好转，毛发光泽较前好转，体质量维持且有小幅度增长，尿量减少。正常组死亡大鼠2只，模型组死亡4只，中药组死亡4只。

2.2 常规指标

2.2.1 3组8、12周末24 hUTP、Glu及体质量比较 见表1。

表1 3组8、12周末24 hUTP、Glu及体质量比较

周数n正常组模型组中药组FP24hUTP(mg)8811.95±3.9795.69±96.33*11.91±5.89△6.6530.00612811.32±2.2176.39±73.13*22.29±13.18△4.5400.024Glu(mmol/L)887.16±0.3239.62±4.33*32.99±12.91*36.8660.00021287.32±0.5832.85±15.27*28.94±9.11*13.7440.0002体质量(g)88431.9±44.9294.7±89.7*248.4±28.8*24.8010.0004128433.2±13.2255.6±60.0*○293.4±51.7*△○15.4780.009

与正常组同期比较,*P<0.05；与模型组同期比较，△P<0.05； 与本组8周体质量比较，○P<0.05

由表1可见，第8、12周末模型组24 hUTP、Glu、体质量与正常组比较差异均有统计学意义(P<0.05)；第8、12周末中药组24 hUTP与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)；第8、12周末中药组Glu与模型组相比有下降趋势，但无统计学意义(P>0.05)；第8、12周末中药组体质量与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)；第12周与第8周相比，中药组体质量上升趋势，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2.2 3组8、12周末BUN、Cr、TG、TC及CGRP比较 见表2。

表2 3组8、12周末BUN、Cr、TG、TC及CGRP比较

周数n正常组模型组中药组FPBUN(mmol/L)887.05±0.5314.63±1.77*20.12±5.85*△28.4480.00011287.01±0.2313.03±3.34*○11.59±2.46*○○10.2150.001Cr(μmol/L)8823.56±1.5124.17±5.4222.13±2.641.0150.3812821.28±1.3523.83±5.6419.37±3.622.8460.082TG880.76±0.212.77±1.65*1.79±2.41△2.7080.0411280.77±0.382.27±0.12*1.17±0.61△6.1630.008TC881.84±0.262.45±0.33*1.96±0.48△5.3100.0141281.88±0.122.30±0.21*2.10±0.266.7340.006CGRP(ng/L)8817.84±3.8927.03±5.38*34.92±15.30*△4.4210.02012818.32±3.1431.10±11.2647.74±19.67*△○8.2260.002

与正常组同期比较，*P<0.05；与模型组同期比较，△P<0.05； 与本组8周末CGRP比较，○P<0.05；与本组8周BUN比较，○○P<0.05

由表2可见，第8、12周末模型组BUN与正常组同期比较差异有统计学意义(P<0.05)；第12周末中药组BUN与模型组相比有下降趋势，第12周与第8周相比中药组下降，差异有统计学意义(P<0.01)；随着造模时间的延长，模型组血Cr含量比正常组稍有增加，但无统计学意义(P>0.05)，第12周末中药组与模型组相比有下降趋势，无统计学意义(P>0.05)；第8、12周末模型组TG、TC与正常组同期比较差异均有统计学意义(P<0.05)，第8、12周末中药组TG与模型组相比有下降趋势，比较差异有统计学意义(P<0.05)，第12周末中药组TG与模型组相比有下降趋势，第12周与第8周相比中药组下降有统计学意义(P<0.01)，第8周中药组与模型组比较TC下降(P<0.05)，第12周中药组与模型组比较无统计学意义(P>0.05)；第8、12周末模型组和中药组的CGRP升高，与正常组同期比较差异均有统计学意义(P<0.05)，且中药组CGRP与模型组同期比较差异有统计学意义(P<0.05)，第12周与第8周中药组CGRP比较升高，差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨 论

CGRP在体内主要分布于中枢和外周神经系统及某些器官组织中,是目前已知体内最强的舒血管多肽,在许多疾病的发病中有重要意义。CGRP对内皮素(ET)具有生物学拮抗作用。DN在持续高糖情况下，最终可形成糖化终产物(AGE)，AGE与肾小球系膜细胞上特异性受体结合,能增加系膜细胞对细胞因子的释放和细胞外基质的产生,基底膜增厚,进而导致肾小球肥大和肾小球硬化的发生,加重病变[5]。在肾小球滤过率方面,内皮素-1(ET-1)对入球小动脉及出球小动脉有相似的收缩效应,所以跨毛细血管静水压没有或有轻微的下降,而ET-1导致的肾小球系膜细胞收缩则可能是导致肾小球毛细血管超滤系数下降的原因。AGE的小分子量的降解产物能使近端肾小管内皮细胞表达ET的mRNA增加210%,从而使内皮细胞产生ET-1明显增加[6]。肾脏的肾小球毛细血管内皮细胞是合成ET的重要来源[7]。刘红等[8]通过研究糖尿病大血管病变与CGRP的关系，得出结论糖尿病患者ET、CGRP升高,认为CGRP较正常人升高主要与血管病变有关,糖尿病患者在临床尚未出现血管病变时即已有血管内皮功能损害,而CGRP在机体内皮损伤时,对缺血缺氧的心、脑、肾器官组织起到一种保护作用。CGRP升高,是机体对血管损害ET升高的一种代偿反应。CGRP有抑制肾小球系膜细胞收缩的作用,能够增加肾小球毛细血管超滤系数,从而改善肾功能[9]。

西医治疗DN主要依靠降糖、降脂以及血管紧张素转换酶抑制剂和血管紧张素受体阻断剂类药物的应用控制其发展[10],中医药在治疗DN方面显示出明显的优势。DN的发生、发展是糖尿病迁延不愈的后果，伤阴耗气，痰、郁、热、瘀互相胶结，积聚于肾脏，导致肾小球硬化、肾纤维化。耿嘉等[3]认为瘀血内阻是导致DN发生、发展的重要因素。临床上适当使用活血祛瘀药物确可提高疗效，延缓肾功能恶化进程。因此，我们根据临床经验并结合现代中药药理研究筛选出鬼箭羽、丹参，进一步探讨活血化瘀中药防治DN的作用机制。丹参味苦，微寒，具有活血祛瘀、凉血消痈、养血安神的作用。鬼箭羽气微,味微苦涩,性寒,无毒,入厥阴经，具有破血、通经、杀虫、散瘀止痛等功效。二药合用，增强了活血通经、破血祛瘀止痛的作用。现代药理研究表明，鬼箭羽主含黄酮类活性成分，具有降低血糖、调节血脂、改善血流变等作用，其水煎部分降糖、降脂[11]；降低血清胰岛素和胰高血糖素，能够刺激胰岛素分泌[12]；改善糖耐量、血液流变学和微循环，纠正脂质代谢的紊乱，提高超氧化物歧化酶的活力[12]；可以减少肾小管上皮细胞乳酸脱氢酶(LDH)释放率，降低N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)活性，提高碱性磷酸酶(ALP)的活力[13]，通过降低血清TG、低密度脂蛋白、TC含量水平，调整脂质代谢紊乱，减少泡沫细胞的形成和刺激细胞外基质增生，从而改善肾小球硬化[15]；对肾小管上皮细胞具有一定保护作用，可能有预防和减轻DN并发症的作用[15]。丹参主要成分为脂溶性多种丹参酮和水溶性原儿茶酚醛和儿茶酚醛的衍生物—丹参素,二者均能扩张收缩微动脉,加速血流,并具有抗血栓形成,抗血小板聚集,黏附及促进纤维蛋白降解作用[16]；可降低TG[17]，抑制脂质过氧化[18]；减轻蛋白非酶糖化对肾脏的损伤和防止肾小球肥大[19]。

实验结果表明，第8周和12周模型组大鼠24 hUTP、Glu明显升高，BUN升高，体质量下降，且与正常组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。考虑DN模型建立成功，经过活血化瘀中药治疗后，①与模型组相比Glu下降不明显，提示降Glu可能不是活血化瘀中药肾保护作用的主要机制。但随着治疗时间延长至12周，Glu进一步下降，虽没有统计学意义，提示我们若是延长治疗周期，Glu可能会进一步下降。②治疗后24 hUTP下降明显，有统计学意义(P<0.05)；中药组BUN先升后降，且12周和8周比较有统计学意义(P<0.05)；Cr变化不大。提示活血化瘀中药是通过降低蛋白尿来改善肾功能。③第8、12周末模型组TG与正常组同期比较差异有统计学意义(P<0.05)，第8、12周末中药组TG与模型组比较有下降趋势，差异有统计学意义(P<0.05)，且蛋白尿下降和血脂下降成正相关，说明活血化瘀中药对DN大鼠降脂疗效显著。④第8周和12周末中药组CGRP有大幅度的提高，与正常组和模型组比较有统计学意义(P<0.05)。第12周与第8周中药组CGRP比较升高，差异有统计学意义(P<0.05)。提示活血化瘀中药对DN大鼠的血瘀状态有明显改善作用，对血管有扩张作用，通过增加肾脏的血流量，改善肾血液循环及血液灌注，保护肾功能。

综上所述，活血化瘀中药主要是通过降低尿蛋白，增加肾脏的血流量，改善肾血液循环及血液灌注，减轻肾组织病理损害,延缓肾小球的硬化来保护DN大鼠的肾功能，对DN有着良好的治疗作用。

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(本文编辑：董军杰)

Effects of blood activating and stasis-removing Chinese medicine on kidney protection and serum calcitonin generelated peptide in rats with diabetic nephropathy

ZHENGJunfu.

FirstDepartmentofInternalMedicine,BinhaiNewAreaHospitalofTraditionalChineseMedicineinTianjinCity,Tianjin300451

Objective To observe the effects of blood activating and stasis-removing Chinese medicine on kidney protection and serum calcitonin generelated peptide (CGRP) in rats with diabetic nephropathy (DN). Methods The SD rats were divided into normal group (n=16), DN model group (n=16), Chinese medicine group (n=16). The model and Chinese medicine group were established by uninephrectomy and intraperitoneal injection of streptozotocin. Rats in normal and model group received equivalent distilled water. The Chinese medicine group received blood activating and stasis-removing Chinese medicine by gavage after the DN models established successfully. The 24 hour urine proteinuria (24 hUTP), blood glucose (Glu), blood urine nitrogen (BUN), creatinine (Cr) and body weight at the 8 weeks and 12 weeks of treatment were measured. The CGRP was measured by radioimmunoassay. Results There were statistical differences on 24 hUTP, Glu and body weight after 8 weeks and 12 weeks of treatment between model and normal groups (P<0.05). There were statistical differences on 24 hUTP after 8 weeks and 12 weeks of treatment between Chinese medicine and model groups (P<0.05). The Glu after 8 weeks and 12 weeks of treatment in Chinese medicine group with a downward tendency as compared with that in model group, but with no statistical difference (P>0.05). There were statistical differences on body weight after 8 weeks and 12 weeks of treatment between Chinese medicine and model groups (P<0.05). The body weight at the 8 weeks and 12 weeks showed an upward tendency in Chinese medicine group, with statistical difference (P<0.05). There were statistical differences on BUN after 8 weeks and 12 weeks between model and normal group (P<0.05). The BUN at the 12 weeks in Chinese medicine group showed a downward tendency as compared with that in model group, and the BUN in Chinese medicine group showed a downward tendency between the 12 weeks and the 8 weeks, with statistical differences (P<0.05). As the modeling time went on, the Cr in model group was higher than normal group, but with no statistical difference (P>0.05). The Cr at the 12 weeks in Chinese medicine group showed a downward tendency as compared with that in model group, with no statistical difference (P>0.05). The CGRP at 8 and 12 weeks were increased in model and Chinese medicine group as compared with those in normal group at the same period, with statistical differences (P<0.05). There were statistical differences on CGRP between Chinese medicine and model group at the same period (P<0.05). The CGRP at 12 weeks in Chinese medicine group was increased as compared with the 8 weeks (P<0.05). Conclusion Blood activating and stasis-removing Chinese medicine can decrease proteinuria, regulate glycometabolism and protect kidney function in mono-nephrectomy STZ-induced DN rats. Blood activating and stasis-removing Chinese medicine can obviously dilate vessel of kidney, increase kidney blood flow, effectively enhance filtration rate, and reduce kidney damage, thus achieve the protection of kidney functions.

Diabetes; Experimental; Diabetic nephropathy; Traditional Chinese medicine; Rat; Animal

10.3969/j.issn.1002-2619.2016.11.021

郑君芙(1980—)，女，主治医生，硕士。研究方向：中医消化内科。

R-332；R587.1；R692.390.531

A

1002-2619(2016)11-1688-05

2016-08-15)