miR-155靶向调控SP1、E2F2 mRNA转录水平的功能验证

赵盼，刘真，管静芝，袁龙，舒彬，尹斌

(1河北北方学院研究生部，河北张家口075000；2中国人民解放军第309医院)

miR-155靶向调控SP1、E2F2 mRNA转录水平的功能验证

赵盼1，刘真2，管静芝2，袁龙2，舒彬2，尹斌2

(1河北北方学院研究生部，河北张家口075000；2中国人民解放军第309医院)

目的 观察微小RNA155(miR-155)对端粒酶逆转录酶(hTERT)调控相关蛋白特异性蛋白1(SP1)及转录因子E2F2重组质粒表达的影响，为进一步研究miR-155调控肿瘤细胞hTERT表达的机制提供实验基础。方法 采用生物信息学预测软件TargetScan和Miranda预测SP1和E2F2 mRNA 3′-UTR是否是人miR-155的作用靶点。针对SP1和E2F2 mRNA 3′-UTR设计互补的两条寡核苷酸，包括目标序列(即SP1、E2F2野生型序列)及突变序列(SP1-mu、E2F2-mu)，构建SP1和E2F2 mRNA 3′-UTR报告基因载体pMIR-SP1、pMIR-E2F2、pMIR-SP1-mu和pMIR-E2F2-mu。培养HEK-293细胞，采用脂质体法将SP1和E2F2的野生型和突变型pMIR-Luc质粒共转染HEK-293细胞24 h。将细胞分为SP1空白对照组、SP1目标序列组、SP1突变序列组、E2F2空白对照组、E2F2目标序列组、E2F2突变序列组，均加入0.2 μg重组质粒、0.01 μg对照质粒和0.375 μL寡核苷酸，培养24 h。采用双荧光素酶报告基因系统检测双荧光素酶活性，以萤火虫荧光素酶活性值(F)/海肾荧光素酶活性值(R)比值评价miR-155与SP1及E2F2 mRNA 3′-UTR结合效果。结果 在线预测结果示，SP1 mRNA 3′-UTR和E2F2 mRNA 3′-UTR均有与miR-155完全互补配对的序列，确定二者均为miR-155的靶基因。经鉴定，SP1和E2F2报告基因重组质粒构建成功。SP1目标序列组F/R低于SP1空白对照组及SP1突变序列组(P均<0.05)，E2F2目标序列组F/R低于E2F2空白对照组及E2F2突变序列组(P均<0.05)。结论 成功构建了SP1和E2F2报告基因重组质粒，证实miR-155能够靶向结合SP1和E2F2 mRNA 3′-UTR，在转录后水平抑制SP1和E2F2的表达。

特异性蛋白1；E2F2转录因子；微小RNA155；荧光素酶报告基因；人端粒酶逆转录酶；质粒

端粒位于真核生物线状染色体末端，是维持染色体完整性与稳定性的重要结构。端粒酶是细胞内具有延长端粒作用的逆转录酶，可保持端粒伸缩的动态平衡，弥补DNA复制过程中端粒末端的消耗[1]。端粒酶逆转录酶(hTERT)是端粒酶的主要结构之一，与端粒酶活性有关[2]。近年研究发现，hTERT在癌组织及癌前病变组织中高表达，而在正常组织中低表达或不表达[3]。hTERT转录位点上游的核心启动子中有与多种转录因子结合的位点，与不同的转录因子结合后可激活或抑制hTERT表达。特异性蛋白1(SP1)和转录因子E2F2是与细胞周期调控有关的转录激活因子，能够调控hTERT的表达[4,5]。微小RNA(miRNA)是一类广泛存在于真核细胞中的内源性非编码RNA，参与基因转录后表达的调控，其中miRNA155(miR-155)在多种肿瘤组织中高表达，在肿瘤的发生发展中发挥重要作用。但miR-155是否通过调控转录因子SP1、E2F2进而调控hTERT的表达，目前尚不明确。2015年3～10月，我们构建了SP1及E2F2 mRNA的3′端非翻译区(3′-UTR)报告质粒并转染人胚肾HEK-293细胞，与miR-155共培养，观察miR-155对SP1和E2F2重组质粒表达的影响，为进一步研究miR-155调控肿瘤细胞hTERT表达的机制提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 大肠杆菌感受态DH5α、对照质粒pRL-TK和人胚肾HEK-293细胞由解放军第309医院结核病研究所孙卫国博士惠赠。miR-155模拟物(miR-155 mimics)、miRNA对照剂(miRNA-control)(上海吉玛制药技术有限公司)；寡核苷酸片段(Invitrogen公司)；限制性内切酶SpeⅠ、Hind Ⅲ、Apa I和T4 DNA连接酶(大连Takara生物有限公司)；Dual-Luciferase报告基因检测系统(Promega公司)；LipofectmineTM2000和Opti-MEM®Ⅰ不含血清的优化培养基(Promega公司)；低温连接仪(珠海黑马医学仪器有限公司)；IMS-30全自动雪花制冰机(雪科电器有限公司)；恒温培养振荡器(上海智城分析仪器制造有限公司)；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(美国Omega Bio-Tek公司)；质粒中量制备试剂盒(AxyGen公司)；Gen5酶标仪(美国Bio-Tek公司)；低温台式高速离心机(德国Eppendorf公司)；CO2恒温细胞培养箱(日本SANYO公司)。

1.2 SP1、E2F2 mRNA 3′-UTR与miR-155靶基因互补性预测 采用生物信息学预测软件TargetScan和Miranda，预测SP1和E2F2 mRNA 3′-UTR是否是人miR-155的作用靶点。以SP1、E2F2 mRNA 3′-UTR二者与miR-155的结合序列至少各存在7个互补结合位点，作为判定SP1和E2F2为人miR-155靶基因的标准。

1.3 SP1和E2F2 mRNA 3′-UTR报告基因载体的构建及鉴定 在TargetScan网站获取SP1 mRNA 3′-UTR和E2F2 mRNA 3′-UTR与miR-155相结合的碱基序列，分别对SP1和E2F2 mRNA 3′-UTR设计互补的两条50～60 nt寡核苷酸，包括目标序列(即SP1、E2F2野生型序列)及突变序列(SP1-mu、E2F2-mu)，分别在5′端添加SpeⅠ和HindⅢ酶切位点，以备后续连接，同时插入ApaⅠ酶切位点，作为后续鉴定的位点。序列如下(下划线部分为SpeⅠ或HindⅢ酶切位点)：SP1正义链为5′-CTAGTGGGCCCCATGGAAGAGAGAGCCATGAAGCATTAAAATGC-ATGGTGTTGAGAAGA-3′，SP1反义链为5′-AGCTTC-TTCTCAACACCATGCATTTTAATGCTTCATGGCTCT-CTCTTCCATGGGGCCCA-3′；SP1-mu正义链为5′-CT-AGTGGGCCCCATGGAAGAGAGAGCCATGAGTAGC-GCGAATGCATGGTGTTGAGAAGA-3′，SP1-mu反义链为5′-AGCTTCTTCTCAACACCATGCATTCGCGCTACTCATGGCTCTCTCTTCCATGGGGCCCA-3′；E2F2正义链为5′-CTAGTGGGCCCCACTTTTTAGAAAAGT-TTGTAGCATTAAGCTGGTTTAAAATATGAAGA-3′，E2F2反义链为5′-AGCTTCTTCATATTTTAAACCAGCT-TAATGCTACAAACTTTTCTAAAAAGTGGGGCCCA-3′；E2F2-mu正义链为5′-CTAGTGGGCCCCACTTTTTA-GAAAAGTTTGTCTAGCGGCGCTGGTTTAAAATATG-AAGA-3′，E2F2-mu反义链为5′-AGCTTCTTCATAT-TTTAAACCAGCGCCGCTAGACAAACTTTTCTAAAA-AGTGGGGCCCA-3′。寡核苷酸链两两互补进行退火，作为与pMIRREPORTTM Luciferace质粒(为携带荧光素酶基因的载体，以下简称为pMIR-Luc质粒)连接的目的片段。将空载体pMIR-Luc质粒(SpeⅠ或HindⅢ)双酶切后，与插入的各目的序列连接过夜。连接完成后，将连接产物重组质粒pMIR-Luc-SP1、pMIR-Luc-SP1-mu、pMIR-Luc-E2F2和pMIR-Luc-E2F2-mu分别转化至感受态大肠埃希菌DH5α进行扩增，挑取阳性单克隆菌落摇菌过夜，构建SP1和E2F2 mRNA 3′-UTR报告基因载体pMIR-SP1、pMIR-E2F2、pMIR-SP1-mu和pMIR-E2F2-mu。质粒抽提并进行酶切鉴定后，送至北京博艾永华生物科技公司测序。

1.4 细胞培养 HEK-293细胞贴壁培养于含10%胎牛血清的1640培养基，放置于37 ℃、5%CO2培养箱进行培养。取对数生长期细胞进行实验。

1.5 质粒转染及分组 采用脂质体法将SP1和E2F2的野生型和突变型pMIR-Luc质粒共转染HEK-293细胞24 h。转染前24 h，将对数生长期的HEK-293细胞消化脱壁后，调整细胞悬液密度至2×105/mL，接种于96孔板，每孔加无抗1640培养基100 μL，37 ℃培养至细胞密度约培养孔面积的75%～80%时开始转染。转染分组：SP1空白对照组、SP1目标序列组、SP1突变序列组、E2F2空白对照组、E2F2目标序列组、E2F2突变序列组，每组均设3个复孔，用25 μL Opti-MEM®Ⅰ培养基稀释LipofectamineTM2000脂质体0.5 μL，轻柔混合，室温静置5 min，然后按每孔量用25 μL Opti-MEM®Ⅰ培养基稀释0.2 μg重组质粒、0.01 μg对照质粒pRL-TK和0.375 μL寡核苷酸(SP1空白对照组加入pMIR-SP1质粒0.2 μg、pRL-TK质粒0.01 μg、miRNA-control 0.375 μL；SP1目标序列组加入pMIR-SP1质粒0.2 μg、pRL-TK质粒0.01 μg、miR-155 mimics 0.375 μL；SP1突变序列组加入pMIR-SP1-mu质粒0.2 μg、pRL-TK质粒0.01 μg、miR-155 mimics 0.375 μL；E2F2空白对照组加入pMIR-E2F2质粒0.2 μg、pRL-TK质粒0.01 μg、miR-control 0.375 μL；E2F2目标序列组加入pMIR-E2F2质粒0.2 μg、pRL-TK质粒0.01 μg、miR-155 mimics 0.375 μL；E2F2突变序列组加入pMIR-E2F2-mu质粒0.2 μg、pRL-TK质粒0.01 μg、miRNA-155 mimics 0.375 μL)，分别将各组50 μL最终混合物混匀室温孵育20 min后，加至含细胞和培养基的培养孔，轻柔震荡培养板混匀，37 ℃、5%CO2条件下孵育细胞，4 h后更换完全1640培养基，继续培养至24 h。

1.6 miR-155与SP1及E2F2 mRNA 3′-UTR结合效果检测 采用双荧光素酶活性检测实验。取各组转染后细胞，依据Dual-Luciferase报告基因检测试剂盒说明书，使用酶标仪Gen5检测各孔细胞萤火虫荧光素酶活性值(F)与海肾荧光素酶活性值(R)，以F/R值作为各孔细胞的相对活性值。

2 结果

2.1SP1、E2F2mRNA3′-UTR与miR-155靶基因的互补性TargetScan及Miranda在线预测结果示，SP1mRNA3′-UTR和E2F2mRNA3′-UTR均有与miR-155完全互补配对的序列，其中miR-155与SP1mRNA3′-UTR的98～105位点结合、与E2F2mRNA3′-UTR的1540～1547位点结合，其互补结合序列均在7个位点以上，预测二者均为miR-155的靶基因。

2.2SP1、E2F2mRNA3′-UTR报告基因载体鉴定结果 酶切鉴定示，SP1、E2F2mRNA3′-UTR重组质粒均被成功线性化，出现大小6 500bp左右的条带。测序结果证实在SP1、E2F2mRNA3′-UTR中插入的目的片段与设计片段完全相符，见图1。

图1 SP1、E2F2 mRNA 3′-UTR报告基因载体测序结果

2.3 miR-155与SP1 mRNA 3′-UTR结合效果检测 SP1空白对照组、SP1目标序列组、SP1突变序列组F/R分别为3 744.93±48.96、2 852.31±340.65、4 356.38±690.45，SP1目标序列组F/R低于SP1空白对照组及SP1突变序列组(P均<0.05)，SP1空白对照组与SP1突变序列组差异无统计学意义(P>0.05)。

2.4 miR-155与E2F2 mRNA 3′-UTR结合效果检测 E2F2空白对照组、E2F2目标序列组、E2F2突变序列组F/R分别为3 640.64±611.93、2 103.35±137.12、3 066.05±245.93，E2F2目标序列组F/R低于E2F2空白对照组及E2F2突变序列组(P均<0.05)，E2F2空白对照组与E2F2突变序列组差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨论

端粒酶激活是肿瘤发生发展的关键因素之一。正常人体只有造血细胞、干细胞和成纤维细胞等具有端粒酶活性，而在恶性肿瘤细胞中端粒酶则广泛存在。hTERT是决定端粒酶活性的关键因素，也是端粒酶的限速亚单位，它的表达受多种转录因子调控，与肿瘤的发生密切相关。SP1是由Kadonaga等[6]发现的细胞转录因子，参与细胞的生长分化、癌基因与抑癌基因的调控、细胞周期调控等多种生物学进程，与凋亡、肿瘤转移及侵袭关系密切。研究发现，转录因子SP1能与hTERT启动子特异性结合，明显增加转录活性[4]，被认为是hTERT强大的转录激活因子。转录因子E2F2属于E2F转录因子家族，参与细胞周期的调控并发挥重要作用，通过调节细胞周期中靶基因的转录，从而调控细胞的增殖[7]。E2F家族可根据其在细胞周期中的作用分为两大类：激活转录作用的激活子和抑制转录作用的抑制子，其中E2F2是转录激活因子[7,8]。E2F2作为转录因子能够在体外和体内的增殖肝细胞中调节hTERT的差异性表达[5]。

miRNA自发现以来，由于其对基因的靶向调控和在生物学中的重要作用而成为研究热点[9～11]。miRNA可通过互补结合特定的mRNA 3′-UTR，从而降解目的mRNA，或抑制其转录后蛋白质翻译，负向调控靶基因的表达水平[12]。miRNA可与多种靶基因结合，一种miRNA可能调控千百种靶基因。研究发现，miRNA对于肿瘤发生发展的调控发挥重要的作用，其中miR-155被证实在多种肿瘤组织中高表达，参与肿瘤的发生、发展及侵袭。研究发现，miR-155可能通过结合多种靶基因来抑制肿瘤的发生，miR-155在肝细胞癌中高表达，通过上调癌基因胰岛素样生长因子Ⅱ、胰岛素样生长因子I型受体和下调抑癌基因胰岛素样生长因子结合蛋白3，促进肝细胞癌的增殖和迁移[13]。miR-155可通过抑制叉头状转录因子O1增加ROS的产生，从而促进非小细胞肺癌的细胞增殖[14]。miR-155还可靶向结合X连锁凋亡抑制蛋白，调控顺铂诱导的卵巢癌细胞凋亡，是增加卵巢癌干预效果的潜在治疗靶点[15]。

目前研究已证实，miRNA能够通过调控hTERT的表达来影响端粒及肿瘤的生长，如miR-1182在转录后水平通过与hTERT的开放阅读框相结合，调控hTERT的表达，抑制胃癌细胞的增殖和转移[16]。Kasiappan等[17]研究表明，在卵巢恶性肿瘤中miR-498低表达，miR-498能与hTERT的3′UTR靶向结合，抑制hTERT的mRNA水平，这可能是miRNA调节端粒酶的新机制。因此，研究miRNA在hTERT调控中的作用，对于进一步明确肿瘤的发生发展、诊断、治疗及预防具有重要意义。

目前，miRNA调控hTERT的具体机制及转录因子在该调控通路中发挥的作用尚未见报道。报告基因实验是研究miRNA对靶基因调控最常用的方法。本研究采用Targetscan在线预测方法，发现miR-155与转录因子SP1和E2F2 mRNA 3′-UTR互补配对，提示miR-155在mRNA序列水平可与SP1和E2F2互补结合并调控二者的表达；转染后SP1目标序列组F/R低于SP1空白对照组及SP1突变序列组，表明miR-155能与SP1互补结合，抑制SP1 mRNA的表达；转染后E2F2目标序列组F/R低于E2F2空白对照组及E2F2突变序列组，表明miR-155能与E2F2互补结合，抑制E2F2 mRNA的表达，以上结果表明，SP1和E2F2均是miR-155直接调控的靶基因。

综上所述，本研究成功构建了SP1和E2F2报告基因重组质粒，证实miR-155能够靶向结合SP1和E2F2 mRNA 3′-UTR，在转录后水平抑制SP1和E2F2的表达，为后续研究miR-155靶向调控肿瘤细胞hTERT的表达提供了实验依据。

[1] Blackburn EH. Switching and signaling at the telomere[J]. Cell, 2001,106(6):661-673.

[2] Bodnar AG, Ouellete M, Frolkis M, et al. Extension of life-span by introduction of telomerase into normal human cells[J]. Science, 1998,279(5349):349-352.

[3] Dhaene K, Wauters J, Weyn B, et al. Expression profile of telomerase subunits in human pleural mesothelioma[J]. J Pathol, 2000,190(1):80-85.

[4] Deeb D, Brigolin C, Gao X, et al. Induction of apoptosis in pancreatic cancer cells by CDDO-Meinvolves repression of telomerase through epigenetic pathways[J]. J Carcinog Mutagen, 2014,5:177.

[5] Sirma H, Kumar M, Meena JK, et al. The promoter of human telomerase reverse transcriptase is activated during liver regeneration and hepatocyte proliferation[J]. Gastroenterology, 2011,141(1):326-337.

[6] Kadonaga JT, Carner KR, Masiarz FR, et al. Isolation of cDNA encoding transcription factor Sp1 and functional analysis of the DNA binding domain[J]. Cell, 1987,51(6):1079-1090.

[7] Slansky JE, Farnham PJ. Introduction to the E2F family: protein structure and gene regulation[J]. Curr Top Microbiol Immunol, 1996,208(1):1-30.

[8] DeGregori J, Johnson DG. Distinct and overlapping roles for E2F family members in transcription, proliferation and apoptosis[J]. Curr Mol Med, 2006,6(7):739-748.

[9] Liu Z, Wang D, Hu Y, et al. MicroRNA-146a negatively regulates PTGS2 expression induced by Helicobacter pylori in human gastric epithelial cells[J]. J Gastroenterol, 2013,48(1):86-92.

[10] Xiao B, Liu Z, Li BS, et al. Induction of microRNA-155 during Helicobater pylori infection and its negative regulatory role in the inflammatory respons[J]. J Infect Dis, 2009,200(6):916-925.

[11] 田伟,张娟,王利娜.miR-181c在胶质母细胞瘤组织中的表达变化及其对肿瘤细胞侵袭、迁移能力的影响[J]. 山东医药,2016,56(27):1-4.

[12] Hernandez YG, Lucas AL. MicroRNA in pancreatic ductal adenocarcinoma and its precursor lesions[J]. World J Gastrointest Oncol, 2016,8(1):18-29.

[13] El Tayebi HM, Waly AA, Assal RA, et al. Transcriptional activation of the IGF-Ⅱ/IGF-1R axis and inhibition of IGFBP-3 by miR-155 in hepatocellular carcinoma[J]. Oncol Lett, 2015,10(5): 3206-3212.

[14] Hou L, Chen J, Zheng Y, et al. Critical role of miR-155/FoxO1/ROS axis in the regulation of non-small cell lung carcinomas[J]. Tumour Biol, 2016,37(4):5185-5192.

[15] Chen W, Huang L, Hao C, et al. MicroRNA-155 promotes apoptosis in SKOV3, A2780, and primary cultured ovarian cancer cells[J]. Tumour Biol, 2016,37(7):9289-9299.

[16] Zhang D, Xiao YF, Zhang JW, et al. miR-1182 attenuates gastric cancer proliferation and metastasis by targeting the open reading frame of hTERT[J]. Cancer Lett, 2015,360(2):151-159.

[17] Kasiappan R, Shen Z, Tse AK, et al. 1,25-Dihydroxyvitamin D3suppresses telomerase expression and human cancer growth through microRNA-498[J]. J Biol Chem, 2012,287(49):41297-41309.

国家自然科学基金资助项目(81170329)；全军医学科技青年培育项目(15QNP049);解放军309医院院管课题(2014MS-001)。

管静芝(E-mail: jzjz1970@hotmail.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.46.009

R730.231

A

1002-266X(2016)46-0035-04

2016-05-14)