人参皂苷对低氧诱导ARPE-19细胞表达VEGF的影响

高娜，亢泽峰

人参皂苷对低氧诱导ARPE-19细胞表达VEGF的影响

高娜1，亢泽峰2

目的探讨人参皂苷对低氧诱导的人视网膜色素上皮细胞（ARPE-19）表达血管内皮生长因子（VEGF）的影响。方法体外培养ARPE-19细胞，分为正常组，缺氧模型组，人参皂苷组，并设立不同浓度及不同时间组。CCK-8法检测不同时间、不同浓度的人参皂苷对细胞毒性、增殖的影响；酶联免疫吸附试验（ELISA）检测各组细胞中VEGF的表达。结果缺氧模型组与正常组比较，ARPE-19细胞的增殖及VEGF的表达高于正常组，差别具有统计学意义（P＜0.05）；缺氧后人参皂苷组与模型组比较，ARPE-19细胞的增殖及VEGF的表达低于模型组，差别具有统计学意义（P＜0.05）。结论人参皂苷可抑制缺氧损伤后ARPE-19细胞的增殖及VEGF的表达。

人参皂苷；视网膜色素上皮细胞；细胞增殖；血管内皮生长因子

脉络膜新生血管（choroidal neovascularization，CNV）形成过程具有复杂的病理生理机制，其发病机制尚不明确。研究表明人类疾病和动物模型的CNV细胞成分主要由RPE细胞、血管内皮细胞、血管平滑肌细胞等组成，其中RPE细胞由视网膜外层RPE增殖移行而来，在CNV形成的不同阶段，起着不同的作用。在新生血管形成的起始期和活动期缺血缺氧、氧化应激、衰老等因素可诱发RPE细胞分泌VEGF及其他促血管生长因子，进而促进内皮细胞的活化、增生和移行，从而诱发CNV。可以看出，在CNV的各个阶段中，RPE细胞及血管内皮细胞都是病变的中心环节之一〔1〕。本实验通过人视网膜色素上皮细胞（ARPE-19）缺氧细胞模型，观察人参皂苷Rg3对低氧诱导后ARPE-19细胞的增殖及VEGF表达的影响，为临床治疗CNV提供实验依据。

1 材料与方法

1.1药物与主要试剂及仪器

人视网膜色素上皮细胞（ARPE-19细胞株，购自广州吉妮欧生物科技有限公司，批号：ATCCCRL-2302）。人参皂苷Rg3（上海历鼎生物技术有限公司，批号：130725，20 mg/支，标准品，纯度≥98%）。MEM培养液（Hyclon公司）；胎牛血清（GIB鄄CO公司）；CoCl2（北京化工公司）；细胞增殖-细胞毒性检测试剂盒cck-8（日本同仁化学研究所）；VEGF（h）ELISA试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）等。荧光倒置显微镜（Olympus，IX81）；5%CO2培养箱（Thermo electron corporation）；全自动酶标仪（Katyo）；离心机（Germany）等。

1.2细胞培养及分组

ARPE-19细胞培养方法：ARPE-19细胞按常规细胞培养法培养，取对数生长期良好的细胞用于实验。实验分为：正常组，缺氧模型组，人参皂苷组，并设立不同浓度及24、48、72 h三个时间组。

1.3CCK-8法检测不同浓度的人参皂苷Rg3对细胞毒性的影响

取对数生长期良好的第8代细胞，0.25%胰酶消化并用台盼蓝染色计数，用含15%胎牛血清（FBS）的MEM制成3×104/mL的细胞悬液，接种于96孔培养板中，每孔200μL，分为正常组，不同浓度（25、50、100、200、400mg/L）人参皂苷Rg3组，置37℃、5%CO2细胞培养箱中培养，24 h后弃培养液，加入不含胎牛血清的MEM继续培养12 h，再次弃培养液，根据分组不同，分别加入含不同浓度药物的培养液。正常组每孔加入不含FBS的MEM培养液100μL，人参皂苷Rg3组按终浓度为25、50、100、200、400 mg/L加入，每个浓度设5个复孔，每孔100 μl，在37℃、5%CO2细胞培养箱中继续培养，各组分别培养24 h、48 h、72 h后，CCK-8每孔加入20 μL，继续孵育4 h后置酶标仪上，测各孔450 nm光密度（OD）值。实验重复3次。

1.4缺氧细胞模型的建立

在前期细胞实验中已成功建立缺氧细胞模型，本实验缺氧模型组均按CoCl2化学诱导缺氧，浓度同前采用100 μmol/L CoCl2进行实验〔2〕。

1.5CCK8法检测CoCl2诱导后各组细胞增殖活性

接种细胞同前，分为正常组、缺氧模型组（100μmol/L）、人参皂苷组（50、100、200 mg/L）。37℃，5%CO2细胞培养箱中培养，24 h后弃培养液，加入不含胎牛血清的MEM继续培养12 h，再次弃培养液，根据分组不同，分别加入含不同浓度药物的培养液。正常组每孔加入不含FBS的MEM培养液100μL，缺氧模型组加入含100μmol/L的CoCl2培养液100μL，药物组分别加入100 μmol/L浓度的CoCl2和各组不同药物浓度的混合培养液100 μL。在37℃、5%CO2细胞培养箱中培养，各组分别培养24 h、48 h、72 h后，每孔加入CCK-8 20 μL，继续孵育4 h后置酶标仪上，测各孔450nm光密度（OD）值。实验重复3次。

1.6ELISA法检测培养液中VEGF的表达

取对数生长期良好的第8代细胞，0.25%胰酶消化并用台盼蓝染色计数，用含15%胎牛血清的MEM制成5×104/mL的细胞悬液，接种于24孔培养板中，每孔1mL，每组设5个复孔。分为正常组，缺氧模型组（100μmol/L），人参皂苷组（100mg/L、200mg/L）。细胞的培养、加药方法同增殖实验，收集细胞培养液上清于离心管内，样品检测前存储于-80℃备用。按照人VEGF ELISA检测试剂盒的说明进行操作。

1.7统计学方法

2 结果

2.1CCK-8法检测不同浓度各组药物对细胞毒性的影响

25、50、100、200、400 mg/L浓度的人参皂苷各组不同时间（24 h、48 h、72 h）的光密度（OD）值与正常组比较（表1），差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 不同浓度人参皂苷对ARPE-19细胞毒性的影响（x±s）

2.2CCK8法检测各组细胞的增殖能力

缺氧模型组（100 μoml/L CoCl2）24、48、72h光密度（OD）值与同时间正常组比较，均高于正常组（P＜0.05）；人参皂苷100、200 mg/L浓度组24、48、72 h光密度（OD）值与模型组比较，低于模型组（P＜0.05）；人参皂苷组50mg/L浓度组24、48、72 h光密度（OD）值与模型组比较，P＞0.05，差异无统计学意义（表2）。

表2 人参皂苷对缺氧诱导的ARPE-19细胞增殖能力的影响

表2 人参皂苷对缺氧诱导的ARPE-19细胞增殖能力的影响

注：a与正常组比较P＜0.05；b与模型组比较P＜0.05。统计学方法：单因素方差分析。ARPE-19：人视网膜色素上皮细胞

组别样本量OD值（24h）OD值（48h）OD值（72h）正常组模型组50 mg/L 100 mg/L 200 mg/L F值P值55555 0.924±0.115 1.403±0.245a1.321±0.151 0.981±0.050b1.190±0.184b14.867 0.000 1.060±0.213 1.498±0.015a1.346±0.249 1.042±0.260b1.181±0.184b4.494 0.009 1.146±0.109 1.657±0.139a1.513±0.092 1.323±0.093b1.370±0.041b18.591 0.000

2.3ELISA法检测培养液中VEGF的表达

缺氧模型组VEGF的表达与正常组比较，24h、48h、72h光密度值（OD）显著高于正常组，差异有统计学意义（P＜0.05）；人参皂苷组（100、200 mg/L）24 h、48h、72hVEGF表达的光密度值（OD）与模型组比较，显著低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）；与正常组比较，P＞0.05，差异无统计学意义（表3）

表3 ARPE-19细胞培养液上清中VEGF的含量（x±s，pg/ml）

3 讨论

人参味甘微寒，具有大补元气、复脉固脱、补脾益肺、生津养血、安神益智明目之功效。最早记载于《神农本草经》，为五加科珍贵中药材，有“百草之王”的美誉。现代药理学研究表明，人参皂苷和人参多糖是人参的主要药效成分，特别是皂苷研究比较深入，其在调节免疫功能、调节中枢神经系统、改善心脑血管疾病、抗压抗疲劳、抗氧化、抗炎、抗肿瘤等方面有着很好的功效，具有广阔的应用前景〔3-4〕。

人参皂苷Rg3是从人参中提取出来的单体皂苷，属原人参二醇型皂苷，存在两种同分异构体，作用机制具有多靶点、多环节、多效应的特点。大量研究表明，其可作用于肿瘤发生、发展的多个环节。目前国内外研究集中在抑制肿瘤细胞增殖、浸润和转移、抑制新生血管生成、促进肿瘤细胞凋亡、影响肿瘤细胞信号传导相关基因的表达和增强免疫能力等方面。人参皂苷Rg3无细胞毒作用，但具有明显的抗大肠癌、肺癌和卵巢癌等多种肿瘤生长和转移的作用〔5-6〕。体内外实验已证实Rg3可通过抑制PI3K活性，抑制AKT的表达及HIF-1的活化，特别是能抑制VEGF和碱性成纤维因子的产生与表达，抑制血管内皮细胞的增殖及迁移能力，直接影响到血管生成，进而抑制肿瘤生长和转移〔7-8〕。研究表明人参皂苷Rg3还可以通过减少VEGF的表达而抑制角膜和视网膜新生血管的形成〔9-10〕。但对于脉络膜新生血管形成的作用迄今尚未见研究报告。

眼科临床使用的各种抗VEGF或作用于VEGF信号通路中不同环节的药物，可抑制VEGF产生或与受体结合发生级联反应，从而抑制新生血管生长及血管渗漏，达到改善患者视力的目的〔11-12〕。本实验通过体外培养ARPE-19细胞，采用CoCl2制造缺氧模型，观察ARPE-19缺氧后细胞的增殖及VEGF的表达。在细胞增殖方面：缺氧模型组（100 μoml/L CoCl2）24、48、72 h光密度值（OD）与同时间正常组比较，高于正常组（P＜0.05）；人参皂苷100、200 mg/L浓度组24、48、72 h光密度（OD）值与模型组比较，低于模型组（P＜0.05）；而人参皂苷50 mg/L浓度组各时间点的光密度（OD）值与模型组比较，P＞0.05，差异无统计学意义；说明100、200 mg/L浓度的人参皂苷Rg3可抑制细胞的增殖，而低浓度的人参皂苷Rg3则达不到此作用。同样在VEGF表达的实验结果中显示，缺氧模型组VEGF的表达与正常组比较，各时间点光密度值（OD）显著高于正常组（P＜0.05）；人参皂苷组（100、200 mg/L）各时间点VEGF表达的光密度值（OD）与模型组比较，显著低于模型组（P＜0.05）；与正常组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。说明浓度为100、200 mg/L的人参皂苷Rg3可抑制细胞中VEGF的表达。

本实验初步探讨了人参皂苷Rg3对细胞的增殖及VEGF表达的影响，为下一步的研究奠定了基础，我们将进一步深入探讨人参皂苷Rg3是如何调控VEGF的表达从而达到抑制CNV形成的。

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Effects of Ginseng Saponin on expression of VEGF in hypoxia induced ARPE-19 cells

GAO Na，KANG Zefeng.Xining No.2 People's Hospital，Xining 810003，China

OBJECTIVETo explore the effects of ginseng saponin on expression of VEGF in hypoxia induced ARPE-19 cells.METHODSThe ARPE-19 cells cultured in vitro were randomly divided into the normal control group，hypoxic model group and ginseng saponin groups.Ginseng saponin groups contained different concentration and duration subgroups.Effects of cytotoxicity and proliferation of ARPE-19 cells under various concentration and duration of ginseng saponin were detected by CCK-8 method，and the effect on VEGF expression was measured by ELISA.RESULTSBoth cell proliferation and VEGF expression of hypoxic model group were higher than normal control group，the difference between them had statistical significance（P＜0.05）.The cell proliferation and VEGF expression of every ginseng saponin group was lower than hypoxic model group.The differences had statistical sig鄄nificance（P＜0.05）.CONCLUSIONSGinseng saponin could inhibit the ARPE-19 cells proliferation and VEGF expression in hypoxic environment.

ginseng saponin；retinal pigment epithelium；cell proliferation；VEGF

R285.5

：A

：1002-4379（2016）05-0291-04

10.13444/j.cnki.zgzyykzz.2016.05.004

国家自然科学基金面上项目（81574032）

1青海省西宁市第二人民医院眼科，西宁810003 2中国中医科学院眼科医院，北京100040

亢泽峰，E-mail：zefeng2531@163.com