沙棘叶中科罗索酸浓缩工艺初探

田晓东，张璐，张琼姝，王斌，张吉科，郭海利，张小民

（1.山西大学生命科学学院，山西太原030006；2.山西金科海生物科技有限公司，山西太原030006）

沙棘叶中科罗索酸浓缩工艺初探

田晓东1，张璐1，张琼姝1，王斌1，张吉科2，郭海利2，张小民1

（1.山西大学生命科学学院，山西太原030006；2.山西金科海生物科技有限公司，山西太原030006）

通过对沙棘叶除杂和多种有机溶剂提取，对沙棘叶中科罗索酸进行了浓缩并通过高效液相色谱法测定其含量。结果表明，最佳浓缩方法是先将沙棘叶水提去除水溶性杂质，再用低醇去除醇溶性杂质，最后热乙醇提取，所得乙醇粗提物中科罗索酸含量为2.14%。该方法安全、简便，为从沙棘叶中获得高纯度的科罗索酸奠定了基础。

沙棘叶；科罗索酸；浓缩；测定

沙棘（Hippophae rhamnoides L.）是胡颓子科沙棘属植物，生长于半干旱区域的灌木或乔木，在山西、陕西、青海、甘肃、内蒙古等省份广泛分布，具有重要的生态价值、经济价值和药用价值[1-2]。因其具有较强的适应能力和繁殖能力以及在林业和水土保持领域的卓越贡献，沙棘在许多省份推广种植。仅山西省沙棘种植面积就多达13万hm2[3]。沙棘果和叶中含有多种生物活性物质，如黄酮类、萜类、维生素、多糖等[4]。在医药方面，沙棘果和种子的研究报道较多，而对沙棘叶研究较少。姚凌云等[5]首次从沙棘叶中分离得到科罗索酸。

科罗索酸（corosofic acid）也称为2α-羟基熊果酸，是一种存在于多种植物中的三萜酸类化合物，因其在降血糖、抗炎、抗肿瘤、抗心血管疾病方面有着显著作用而受到国内外医药工作者的广泛关注。尤其是在降糖方面，科罗索酸被称作“植物中的胰岛素”，开发利用价值极高。在临床试验中，Ikeda等[6-7]均发现科罗索酸具有明显的降糖效果。吴哲等[8]测得沙棘叶中科罗索酸的含量为0.055 0%。与富含科罗索酸的枇杷叶[9]和大花紫薇叶[10]相比，沙棘叶中科罗索酸含量较低，纯化成本较高。科罗索酸治疗糖尿病的剂量为4 mg/kg[11]，对于体质量70 kg的成年患者，每日剂量为280 mg。如果将沙棘叶用于降糖保健品的开发，考虑到提纯科罗索酸的成本较大，只需将沙棘叶中科罗索酸浓缩至1%～3%，方可达到降低血糖的目的。

本试验将初步探究和比较从沙棘叶中浓缩科罗索酸的不同工艺，并选择最佳的浓缩方法，旨在为进一步开发利用沙棘叶中的科罗索酸奠定一定的基础。

1 材料和方法

1.1 材料和试剂

沙棘叶购买自山西金科海生物科技有限公司；科罗索酸（标品）购买自上海诗丹德生物技术有限公司；无水乙醇和甲醇购买自天津市风船化学试剂科技有限公司。

旋转蒸发仪（RE-3000型，上海亚荣生化仪器厂）；电热鼓风干燥箱（GZX-9076MBE型，上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；电子分析天平（AB104-N型，瑞士梅特勒-托利多）；恒温水浴锅（HHS型，上海博讯实业有限公司医疗设备厂）。

1.2 试验设计

1.2.1 浓缩工艺方法一：将一定量的干燥沙棘叶粉碎后过筛（0.18 mm），浸置于蒸馏水中，加热至80℃，浸泡4 h，过滤弃滤液后，将沙棘叶在烘箱中60℃烘干。烘干后的沙棘叶置于圆底烧瓶中，按料液比1∶10加入无水乙醇，90℃水浴煎煮3 h，过滤后将滤液迅速倒入旋转蒸发瓶，减压浓缩提取液，回收无水乙醇，最后在电热恒温鼓风干燥箱中干燥浓缩液，制得浸膏，4℃保存。

方法二：方法同方法一，只是水提烘干后的沙棘叶再用甲醇提取。

方法三：取水提后烘干的沙棘叶，用25%的乙醇在索氏提取器中回流浸提3次，将沙棘叶再次在60℃烘箱中烘干，置于圆底烧瓶中，按料液比1∶10加入无水乙醇，90℃煎煮3 h，过滤，旋转蒸发，浓缩提取液，回收乙醇，制得浸膏，4℃保存。

方法四：取水提后烘干的沙棘叶，经25%的乙醇回流浸提后，再次烘干，置于圆底烧瓶中，按料液比1∶10加入甲醇，90℃煎煮3 h，过滤，浓缩提取液，回收甲醇，制得浸膏，4℃保存。

1.2.2 色谱检测条件流动：甲醇∶1%冰醋酸为83∶17；检测波长为215 nm；流速为1 mL/min；柱温为30℃；色谱柱为Agilent20RBA×SB-C18（4.6mm× 250 mm，5 μm）。

1.2.3 样品的处理精密称取方法一、方法二、方法三和方法四所得到的浸膏各3 g，分别加25 mL的石油醚，浸泡40 min，重复2次。倒去石油醚，干燥后，用甲醇冷浸超声提取2次，每次25 mL，冷浸30 min，超声40 min，合并提取液，过滤，滤液用甲醇定容至100 mL容量瓶，待测。

1.2.4 标准曲线的建立用电子天平准确称取纯科罗索酸18.7 mg，溶解于甲醇中并定容至25 mL，配制成质量浓度为0.748 mg/mL的科罗索酸标准液，取0.5，1，2，4，6 mL分别置于容量瓶中，加甲醇定容至10 mL，各进样20 μL，记录峰面积。横坐标为进样浓度（X），纵坐标为标品色谱图峰面积（Y），可以得到线性方程：Y＝4 805.2X＋37.015（R2＝0.999 65）。

2 结果与分析

参照标品色谱图，保留时间在15 min处的峰所对应的物质是科罗索酸（图1）。样品处理后，用高效液相色谱在1.2.2色谱条件下测试。根据标准曲线，计算上述4种方法制得浸膏中科罗索酸的含量，其中，方法一所得浸膏科罗索酸含量为0.51%（图2）；方法二所得浸膏科罗索酸含量为0.57%（图3）；方法三所得浸膏科罗索酸含量为2.14%（图4）；方法四所得浸膏科罗索酸含量为1.77%（图5）。水提除杂后科罗索酸含量较低，醇提除杂后科罗索酸含量明显升高。

3 讨论

科罗索酸属α-香树脂醇型或乌斯烷型五环三萜类化合物，结构为多氢蒎的五环母核[12]。纯科罗索酸为白色粉末状，不溶于水，可以溶于热乙醇、甲醇。

目前，科罗索酸的来源主要是从天然植物中提取和有机合成，含科罗索酸的植物主要有大叶紫薇和枇杷等，其中，科罗索酸与同为五环三萜类化合物的齐墩果酸并存，提纯分离难度较大。鞠建华等[13]将枇杷叶采用95%的乙醇回流提取获得浸膏，后经萃取、洗脱、低压柱色谱分离得到了科罗索酸。陈龙胜等[14]研究了乙醇提取枇杷叶中科罗索酸的提取工艺。纵伟等[10]从大叶紫薇叶中，采用薄层色谱分离方法得到了科罗索酸。刘博等[15]提取山茱萸中科罗索酸时，发现甲醇、乙醇、丙醇这3种提取溶剂均可以提取出中药材中的三萜类物质。孙宏斌等[16]发明了利用化学有机合成法制备科罗索酸。陈剑锋[17]发明了将植物水煮除杂、有机溶剂提取、大孔吸附树脂富集纯化等方法获得科罗索酸。贺建荣等[18]以枇杷叶为原料，先水煮去除水溶性杂质，后低醇去除部分醇溶性杂质，最后甲醇提取得到科罗索酸粗品。朱力杰等[19]从五味子中运用高效逆流色谱分离制得科罗索酸。林国荣等[20]通过乙醇浸提法提取枇杷叶中的熊果酸和科罗索酸。在上述方法中多数使用了甲醇、石油醚等有机溶剂，虽然提取、浓缩的效果比较好，但是工艺较为复杂，有机溶剂的残留不易去除。加之沙棘叶中科罗索酸含量较低，故不适合使用。

在本试验中，第一步都是用水提法除杂，可以去除29.85%的水溶性杂质。由于科罗索酸溶于热乙醇和甲醇，将水提后的沙棘叶弃滤液烘干后，用90℃热乙醇提取，科罗索酸含量0.51%；用90℃甲醇提取，科罗索酸含量为0.57%。由于低醇可以去除部分醇溶性杂质，将水提法除杂后烘干的沙棘叶再次用25%的乙醇除杂，可去除21.36%醇溶性杂质；弃滤液烘干后的沙棘叶用90℃热乙醇提取，科罗索酸含量为2.14%，用90℃甲醇提取，科罗索酸含量为1.77%。由于科罗索酸在热乙醇中的溶解度略高于热甲醇中溶解度，并且考虑到甲醇的毒性和残留量，都会给提取和后期检测带来诸多不便。因此，选用热乙醇作为提取沙棘叶中科罗索酸的提取溶剂。最佳提取方案为：先用水提除杂，再用25%乙醇除杂，最后用热乙醇提取。

该最佳浓缩方法中只使用了水和乙醇，故不存在有毒物残留；而且制备工艺简单、安全、成本低，鉴于科罗索酸在医药领域的重要性，本研究为沙棘叶在医药领域的进一步拓展奠定了基础。

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Preliminary Study on Concentration Process of Corosolic Acid of Sea Buckthorn Leaves

TIAN Xiao-dong1，ZHANG Lu1，ZHANG Qiong-shu1，WANG Bin1，ZHANG Ji-ke2，GUO Hai-li2，ZHANG Xiao-min1
（1.College of Life Sciences，Shanxi University，Taiyuan 030006，China；2.Shanxi Jinkehai Biological Technology Co.，Ltd.，Taiyuan 030006，China）

Through purifying sea buckthorn leaves and using various organic solvent extraction methods,corosolic acid is concentrated.The content of corosolic acid from crude extracts made by four kinds of different concentration method is determined by high performance liquid chromatography.The results indicate that the optimum concentration method is:first using water formulation to remove water soluble impurities in sea buckthorn leaves,and then using low alcohol tore move alcohol soluble impurities,finally using hot ethanol to extract.As a result,the corosolic acid content of ethanol crude extract is 2.14%.This method is safe and simple,and lays a foundation for further obtaining high purity corosolic acid from sea buckthorn leaves.

sea buckthorn leaves;corosolic acid;concentration;determination

S793.6；TQ463

A

1002-2481（2016）02-0239-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.02.28

2015-09-25

田晓东（1990-），男，山西吕梁人，在读硕士，研究方向：天然植物降血糖成分提取。张小民为通信作者。