国标法和纸片法做食品中菌落总数的对比

仝伟建，祖新，段鹏，杨晓楠，李羽翡

（甘肃省食品检验研究院，甘肃 兰州 730030）

国标法和纸片法做食品中菌落总数的对比

仝伟建，祖新，段鹏，杨晓楠，李羽翡

（甘肃省食品检验研究院，甘肃 兰州 730030）

目的：利用纸片法和国标法同时测试食品中菌落总数，根据试验结果来测试纸片法（非标法）在检测食品微生物菌落总数检验中的准确性。方法：用纸片法和国标法（GB 4789.2-2010）在同一人员、相同的试验条件下进行实验，对所得的结果进行对比分析，测试纸片法在菌落总数检验中的准确性。结果：纸片法所得的结果和国标法结果对比显示，对于污染严重的样品，两种方法具有显著性的差异；对于相对洁净的样品，两种方法的结果不具有显著性差异。同时，纸片法所需的时间短，能有效地监控食品被微生物污染的严重程度，但是在精确度上和国标法还是有一定的差距。

国标法和纸片法；食品微生物；检验方法对比

随着人们对食品安全性的重视，应用到食品微生物的检测手段也越来越多，诸多新型的微生物检测技术如雨后春笋般涌出,给微生物检测工作带来了飞跃式的发展,使得食品卫生检验工作得到了良好的改善。如ATP生物发光技术[1]和全自动微生物检测法；在培养基中加入14C标记的碳水化合物或盐类的底物，测量细菌代谢后产生是否产生14CO2的放射测量法；以DNA作为细菌的遗传分子，在微生物检测方面有着独特的优势，目前应用较多的有聚合酶链式反应（PCR）[2]和具有多样化、自动化、微型化等特点的基因芯片技术[3]；利用微生物可以使电惰性底物（如碳水化合物、类脂、蛋白质等）代谢成电活性产物（如乳酸盐、醋酸盐、氨等）的电阻抗检测法[4]；以气相色谱法、mini-VIDAS法以及Vietk-AMS法为主的仪器分析检测的方法[5]；流式细胞术等。这些技术对检验人员的素质、检验仪器、设备等要求较高，有些方法用在微生物检验中还不太成熟[6]，目前最常用的还是形态学和生理生化的方法，但是这些方法操作繁琐、所需时间长、准备工作和后期废弃物处理工作繁重，且需大量的专业技术人员。而纸片法由于使用方便、操作简单，又能有效缩短检验周期而被广泛地应用于监控食品被微生物污染的程度。但是纸片法所得的结果究竟准不准确？它和国标法所得的结果的差距又是多少？下面我们就来研究一下纸片法在食品菌落总数检验中的准确性。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 试剂及仪器

平板计数琼脂（北京陆桥，批号：150504）,菌落总数测试片（国产某厂家），恒温恒湿培养箱，超净工作台。

1.1.2 样品

为确保试验结果的覆盖性和准确性，我们抽取容易受污染的食品（豆腐、肉）和相对较洁净的食品（纯净水）各51个样本。

1.2 方法

1.2.1 国标法

按照国标“菌落总数的测定”规定的方法进行试验[7]。

（1）肉、豆腐样品处理方法：称取25 g样品放入盛有225mL稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1～2min，制成1∶10的样品匀液。

（2）纯净水样品处理方法：瓶口用酒精棉球消毒后，以无菌吸管吸取25 mL样品置盛有225 m L磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1∶10的样品匀液。

（3）用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1∶10样品匀液1 m L，沿管壁缓慢注于盛有9 m L稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1∶100的样品匀液。

（4）按以上操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1次1mL无菌吸管或加样枪枪头。

（5）根据对样品污染状况的估计，选择2～3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10倍递增稀释时，吸取1 mL样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。同时，分别吸取1 m L空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。

（6）及时将15～20 mL冷却至46℃的平板计数琼脂培养基（可放置于46℃±1℃恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。

（7）待琼脂凝固后，将平板翻转，36℃±1℃培养48 h±2 h。

（8）如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基（约4 mL），凝固后翻转平板，按（7）条件进行培养。

（9）按照GB 4789.2-2010中6.3要求的方法对平板进行计数。

（10）按照GB 4789.2-2010中7要求的方法进行结果计算。

1.2.2 纸片法

液体各取1m l，分别加入到2个测试片中；固体取25 g加入到225m l的0.85%的生理盐水中，均质2min（下一步骤同液体样品）。36℃培养18～24 h。计数和结果计算均按照说明书的要求进行。

2 结果

三种样品不同检验方法结果见表1。

表1 三种样品不同检验方法结果

3 分析与讨论

对于污染严重的样品，结果通过统计学计算得出两种方法具有显著性差异，国标法的结果要明显高于纸片法；对相对洁净的样品，纸片法和国标法的结果有非常好的相关性，两者之间无显著性差异；纸片法培养时间对结果有明显影响。培养时间过长,纸片容易干，细菌较多的样品菌落可能重叠在一起，对结果分析的准确性有很大影响，个人认为14 h～16 h是比较理想的培养时间。

GB 4789.2-2008中有纸片法测菌落总数的方法，但是到2010年标准更新了以后08版的菌落总数的测定方法就被取消了，然而GB 4789.2-2003的标准仍然没有作废，这也从另外一个角度说明了纸片法具有一定的局限性。

纸片法和传统的国标法比较，省略了试验前期的准备工作和后期的废弃物处理工作，大大节约了工作时间和劳动强度，并且在检验流程、培养时间等环节都更为简便、快速[8]，用于测试相对洁净的食品被细菌污染的程度还是值得使用的[9]。由于纸片检测法，操作简便，耗时较短，对于检测洁净度较高的食品无显著差异，所以对于一些企业，在保证正常国标法进行出厂检验的同时，可以将纸片法作为一种监测手段。不仅可以对最终产品（成品）进行检测，也可对生产过程中各个阶段的半成品进行监测，通过产品的出厂检验与纸片法对生产产品的过程检测相结合，对于保证生产各阶段的质量控制，提高最终产品的质量，是大有裨益的。

［1］ 孙凤霞.探析食品微生物检验技术的研究进展［J］.中国医药指南,2014，12（23）：69-70.

［2］ 路则宝，白现广.分子生物学技术中微生物检验中的应用研究进展［J］.红河学院学报，2013，11（2）：61-63.

［3］ 熊强，史纯珍，刘钊.食品微生物快速检测技术的研究进展［J］.食品与机械，2009，17（5）：788-789.

［4］ 刘滨思.微生物检验技术的研究进展［J］.食品科学，2013，01（09）：38.

［5］ 王雪丽，蔡丽萍.微生物检验技术研究的进展［J］.化工管理，2015（13）：177.

［6］ 林蕾，张炜.食品微生物检验技术的研究进展［J］.现代农业科学，2008，15（10）：97-99.

［7］ GB 4789.2-2010.食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定［S］.北京：中国标准出版社，2010.

［8］ 李桂贤，张晓威，金晶.纸片法与平板倾注法检测菌落总数试验报告［J］.中国卫生检验杂志，1991，1（2）：123.2.

［9］ 李洪，龚涛，达永淑，等.纸片探讨影响大肠菌群快速纸片法的因素［J］.职业卫生与病伤，2002，17（3）：198-199.

TS207

：A

DOI 10.3969/j.issn.1672-6375.2016.12.010

2016-9-21

仝伟建（1983-），男，汉族，山东金乡人，研究生，中级兽医师，主要从事食品微生物检验工作。