香虎清妇炎颗粒对子宫肌瘤模型大鼠影响的实验研究

韩云霞 李德鑫 赵海

(1.贵阳中医学院第二附属医院药学部，贵州 贵阳550003；2.贵阳职业技术学院，贵州 贵阳550081)



香虎清妇炎颗粒对子宫肌瘤模型大鼠影响的实验研究

韩云霞1#李德鑫2#赵海1△

(1.贵阳中医学院第二附属医院药学部，贵州 贵阳550003；2.贵阳职业技术学院，贵州 贵阳550081)

目的 研究香虎清妇炎颗粒(XHQFYKL)对子宫肌瘤的治疗作用，探讨其部分作用机理，为其临床应用提供实验依据。方法给大鼠肌注雌激素及孕激素造成子宫肌瘤模型，观察XHQFYKL对大鼠子宫肌瘤的病理增生、肌瘤组织中孕激素受体(PR)和雌激素受体(ER)表达的影响，从而探讨XHQFYKL治疗子宫肌瘤的作用机制。结果XHQFYKL有调节卵巢激素的作用，并可抑制子宫平滑肌的增生，能显著减少肌瘤组织中ER、PR的含量。结论XHQFYKL可通过调节卵巢激素治疗子宫肌瘤。

香虎清妇炎颗粒； 子宫肌瘤; 雌激素受体; 孕激素受体

子宫肌瘤是女性生殖系统中较常见的良性肿瘤，也是导致女性切除子宫的重要因素之一。据临床统计，育龄期妇女子宫肌瘤的发病率在20%～25%[1]。目前临床治疗子宫肌瘤多以手术治疗为主，但手术治疗往往具有一定的适应证，且患者的接受程度也限制了其应用，常规的药物治疗大多疗效欠佳[2]。米非司酮是临床中常用于治疗子宫肌瘤的新型抗孕激素，能与孕酮受体及糖皮质激素受体结合，可使子宫肌瘤体积明显缩小[3]。但临床研究发现米非司酮有较多的不良反应，且治疗后常易复发[4]。该病属中医症瘕范畴，因患者气血不和、血瘀凝滞及久瘀成症等因素而引发。我们认为子宫肌瘤正气虚弱是病变基础，血瘀胞宫是病变本质，气虚血瘀是子宫肌瘤的主要病机。香虎清妇炎颗粒是经贵阳中医学院第二附属医院治疗子宫肌瘤的经验方香虎汤加工制备而得，在临床使用有效的基础上，通过实验进一步验证。

本研究以雌激素及孕激素造成子宫肌瘤模型，选以具有相近作用的桂枝茯苓胶囊(GZFLJN)为阳性对照。研究香虎清妇炎颗粒对其的干预，观察子宫形态学改变，以及对血清雌二醇(E2)、孕酮(P)水平的影响，子宫系数及子宫横径的影响，XHQFYKL对大鼠子宫肌组织中ER、PR表达水平的影响，探讨XHQFYKL治疗子宫肌瘤的作用机制。

1 材料与方法

1.1 试验药物

香虎清妇炎颗粒(XHQFYKL)由贵州顺健制药有限公司提供，5 g×10袋/包，批号140601；桂枝茯苓胶囊(GZFLJN)：0.31 g/粒，购自江苏康缘药业股份有限公司，批号Z130801；已烯雌酚注射液：2 mg/1 mL，购自广州明兴制药厂，批号MB130201；黄体酮注射液：20 mg/1 mL，购自浙江仙琚制药股份有限公司，批号121201。

1.2 试验试剂

雌二醇放射免疫分析药盒、孕酮放射免疫分析药盒购自天津九鼎医学生物工程有限公司；兔抗大鼠ER、PR多克隆抗体、即用型链霉素亲和过氧化物酶复合物(SABC)免疫组化试剂盒、DAB显色剂由武汉博士德生物工程有限公司提供。

1.3 实验动物

SD大鼠,雌性,体质量180 ～220 g，合格证号SCXK(黔)2010-0001。

1.4 方法

1.4.1 分组及给药 取SD大鼠72只，随机分为6组，每组12只，即正常对照组、模型组、XHQFYKL低[0.375 g/(kg·d)]、中[(0.75g/(kg·d)]、高[(1.125 g/(kg·d)]剂量组、阳性药对照组[(桂枝茯苓胶囊0.3 g/(kg·d)]。模型组及各给药组大鼠隔日肌注已烯雌酚0.04 mg/只，另每周肌注黄体酮1 mg/只；对照组大鼠隔日肌注花生油0.1 mL/只，共20周。造模第11周起，各给药组及阳性药对照组按上述剂量分别灌胃给予XHQFYKL及GZFLJN；模型组、正常对照组灌胃给予蒸馏水2 mL/只，每天1次，每周6 d，连续10周。

1.4.2 观察指标 实验期间观察动物的一般状况。实验开始至第20周结束后，股动脉取血并处死动物。取血及子宫进行以下指标检查：(1)血清雌二醇、孕酮： 取血，静置后分离血清，放免法测雌二醇、孕酮水平。(2)子宫系数、子宫横径： 取子宫，电子天平称重，计算子宫系数(子宫重量 mg/大鼠体质量 g)，游标卡尺测量子宫分角下(子宫颈以上)及分角根部(一侧分角子宫根部)横径。(3)病理组织检查：对各组大鼠子宫进行肉眼观察，再取子宫分角以上相同部位0.5 cm一段子宫，中性福尔马林固定，石蜡包埋切片，HE染色，光镜下行子宫组织病理检查。

1.4.3 免疫组化方法 检测ER和PR在子宫内膜的表达。结果判定标准： ER和PR阳性表达主要定位于局部组织的表面上皮细胞、腺上皮细胞及间质细胞的胞浆，阳性效应产物为棕黄色颗粒。采用Fromowitz组织化学评分法(H-score)[5]，每张切片随机选择5个不同的高倍视野(×400)，据染色程度(浅、中、深)及范围分别计分，进行结果判定。染色程度：0分，细胞无着色记；1分，细胞轻度着色呈淡黄色记；2分，细胞着色呈棕黄色记；3分，细胞明显着色呈棕褐色记。染色范围：0分，染色范围<5%；1分，染色范围5%～25%；2分，染色范围25%～50%；3分，染色范围>50%。累积上述计分判定结果，0～1分为阴性(-)；2～3分为弱阳性(+)；4～5分为阳性(++)；6分为强阳性(+++)。

1.5 统计学处理

2 结 果

2.1 XHQFYKL对血清雌二醇(E2)、孕酮(P)水平的影响

模型组血清E2、P水平均明显增高，与正常对照组比较，差异有统计学意义(P<0.01)。XHQFYKL各治疗组给药后血清E2、P水平与模型组比较差异有统计学意义(高、中剂量组P<0.01，低剂量组、GZFLJN组P<0.05)。见表1。

注：与对照组比较，▲P<0.01；与模型组比较，*P<0.05,**P<0.01。

2.2 XHQFYKL对子宫系数及子宫横径的影响

模型组子宫重量增加，子宫系数增大，与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.01)。XHQFYKL灌胃给药可不同程度降低子宫系数，与模型组比较，差异有统计学意义，XHQFYKL高、中剂量组(P<0.01)，低剂量组(P<0.05)。见表2。模型组子宫分角下及分角根部宫横径较对照组增加(P<0.01)；XHQFYKL各治疗组两处子宫横径均小于模型组，差异有统计学意义(高剂量组P<0.01，中剂量组、GZFLJN组P<0.05)。见表3。

组别剂量/(g/kg)动物数/只子宫重量/mg子宫系数/(mg/g)正常对照组—11719.88±163.292.95±0.65模型组—111652.15±296.15▲7.47±1.46▲低0.375111486.76±164.07*7.04±0.81*XHQFYKL组中0.75121465.61±93.58**5.89±0.66**高1.125121191.90±137.36**5.33±0.54**GZFLJN组0.3101520.75±58.817.22±0.51

注：与对照组比较，▲P<0.01；与模型组比较，*P<0.05,**P<0.01。

组别剂量/(g/kg)n分角下子宫/cm分角根部子宫/cm正常对照组-110.63±0.140.30±0.06模型组-111.05±0.16▲0.49±0.06▲低0.375110.94±0.14**0.45±0.05XHQFYKL组中0.75120.85±0.12*0.41±0.05*高1.125120.78±0.09**0.36±0.05**GZFLJN组0.3100.85±0.07**0.42±0.07*

注：与对照组比较，▲P<0.01；与模型组比较，*P<0.05,**P<0.01。

2.3 组织形态学影响

肉眼观察模型组子宫较正常对照组体积增大，质地厚实，呈暗红色，部分区域水肿呈空泡状。治疗组子宫体积、颜色与正常对照组接近，呈鲜红色。

镜下观察模型组子宫肌纤维明显增生肥大，肌层明显增厚，肌纤维排列紊乱，呈轻微编织状，出现穿插现象，病变近似平滑肌瘤样增生。见图1。正常对照组子宫肌层薄,肌纤维无增生肥大,内环肌、外纵肌规则排列，见图2。XHQFYKL高、中剂量组子宫肌层明显变薄,肌纤维细长或稍肥大,排列规则,偶见或未见内环肌和外纵肌穿插现象。见图3，4。

图1 模型组 (HE×100) 图2 正常对照组 (HE×100)

图3 高剂量组 (HE×100) 图4 中剂量组 (HE×100)

2.4 XHQFYKL对大鼠子宫肌组织中ER表达的影响

对照组子宫内膜有大量ER阳性表达；模型组ER表达量略低于对照组，差异无统计学意义(P>0.05)，在子宫内膜上皮细胞、腺体上皮细胞和间质细胞的胞浆中都可见棕黄色颗粒状或丝网状阳性表达产物；XHQFYKL高、中、低剂量组ER表达量均明显降低，仅部分细胞有少量棕黄色表达，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

组别nER-++++++Z值对照组111640-模型组1134400.000GZFLJN组105500-2.090△高剂量组128400-2.494△中剂量组127410-2.140△低剂量组116410-2.084△

注：与模型组比较，△P<0.05。

2.5 XHQFYKL对大鼠子宫肌组织中PR表达的影响

对照组子宫内膜有PR表达；模型组PR表达量略低于对照组，但差异无统计学意义(P>0.05)，在表面上皮细胞、间质细胞和腺体的上皮细胞的胞浆中都可见棕黄色颗粒状或丝网状阳性表达产物；XHQFYKL高、中、低剂量组PR表达量均较模型组明显降低，仅部分细胞有少量棕黄色表达，差异有统计学意义(P<0.05)。见表5。

组别nER(-)(+)(++)(+++)Z值对照组112540-模型组113620-0.505GZFLJN组106400-2.182△高剂量组128400-2.248△中剂量组127500-1.996△低剂量组117310-2.060△

注：与模型组比较，△P<0.05。

3 讨 论

传统认为雌激素有诱发并促进子宫肌瘤生长的作用，生物化学测定证实，子宫肌瘤较正常肌层中雌二醇(E2)的浓度明显增高, E2向雌酮(E1)的转化率也低于正常肌组织，提示局部高E2环境的存在可刺激肌瘤的生长[6]。近年来发现孕激素在子宫肌瘤的发生、发展中也有重要作用。分子生物学技术证实,子宫平滑肌瘤组织孕激素受体蛋白和孕激素受体mRNA表达水平比邻近肌层增加,增殖抗原Ki-67明显升高,提示增强的孕激素受体介导的信号与肌瘤生长有关。雌、孕激素与其相应受体结合发挥生物学作用,雌激素和孕激素通过自分泌或旁分泌互相调节,雌激素和孕激素的联合作用使细胞DNA合成及有丝分裂能力进一步增强[7]。孕激素可提高子宫肌瘤细胞上的雌激素受体含量,并通过提高上皮生长因子样蛋白和上皮生长因子受体的含量,间接刺激子宫肌细胞的增生[8]。本实验通过给予大鼠注射外源性雌、孕激素，HE染色显示子宫平滑肌层增生,平滑肌排列紊乱,细胞增大,病理改变与人子宫肌瘤病理组织学结构类似,子宫系数增大，子宫横径增粗，说明模型成功。本模型的成功也说明了高水平雌、孕激素是子宫肌瘤发生的主要原因之一。造模后予XHQFYKL进行治疗，并以桂枝茯苓胶囊作为对照进行实验，通过对子宫系数、子宫横径以及组织病理变化对比发现XHQFYKL能抑制子宫平滑肌瘤样增生。检测血清雌、孕激素水平，结果显示，XHQFYKL有调节雌、孕激素的作用，这可能是其治疗子宫肌瘤的机制之一。

子宫肌瘤是雌激素敏感性肿瘤，多见于性激素功能活跃的育龄妇女，少见于绝经后妇女。临床发现当给予外源性雌激素或妊娠时，子宫肌瘤迅速增大；而绝经后出现的低雌二醇(E2)、低孕酮(P)状态则可引起肌瘤的缩小甚至消失。故长期以来雌激素一直被认为是子宫肌瘤发生和发展的促进剂。激素主要的生物学效应是靠与受体结合后才能得以实现。靶组织保留激素的多少取决于其细胞内相应受体的含量；在同一激素水平下，激素在靶组织中产生生物学效应的强弱也取决于靶细胞受体的含量，说明肌瘤的生长与ER、PR的水平密切相关。

本实验结果显示，大鼠模型组子宫肌组织均有ER、PR表达，但表达量略低于对照组。ER、PR受雌激素调节，雌激素上调ER与PR的表达，孕激素对ER与PR有降调作用。XHQFYKL高、中、低剂量组子宫肌组织中ER、PR表达较模型组均明显减少，表明降低子宫肌瘤组织中ER、PR的表达水平是XHQFYKL治疗子宫肌瘤的可能机制之一。

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读者·作者·编者

医学出版物中部分约定俗成的字词

(1)“症”：用于“症状”、“并发症”、“病症”。(2)“证”：用于“适应证”、“禁忌证”、“证候”。(3)“征”：用于“综合征”、“体征”、“指征”、“征象”。(4)“碱”：用于“酸碱平衡”、“碱性磷酸酶”、“氨茶碱”，不用“硷”。(5)“瘀”：用于“瘀血”、“瘀斑”、“瘀点”，不用“淤”字，中医使用“瘀”、西医多用“淤”。

贵州医药杂志社

Xiang Hu Qing Fu Yan granule experimental study of the effect of the granule on the model of uterine leiomyoma in rats

HanYunxia1#,LiDexin2#,ZhaoHai1.

1.PharmacyDepartment,theSecondAffiliatedHospitalofGuiyangCollegeofTraditionalChineseMedicine,Guiyang550001,Guizhou,China. 2.PharmaceuticalLaboratoryofCareerTechnicalCollegeGuiyang，Guiyang550081,Guizhou,China.

Objective To study the fragrant tiger clear therapeutic effect of Fuyan particles (XHQFYKL) on uterine myoma and to explore the action mechanism and for its clinical application to provide experimental basis. Methods Rats intramuscular injection of estrogen and progesterone caused by uterine myoma model to observe XHQFYKL on rat uterine smooth muscle tumor pathological proliferation, leiomyoma progesterone receptor (PR), the effect of expression of estrogen receptor (ER), so as to explore the mechanism of treatment of uterine fibroids XHQFYKL. Results XHQFYKL there was the role of regulation of ovarian hormones, and can inhibit the proliferation of uterine smooth muscle, can significantly reduce the amount of PR, ER in the uterine leiomyoma tissue.Conclusion XHQFYKL can regulate ovarian hormone treatment of uterine fibroids.

XHQFYKL； Uterine leiomyoma； Estrogen receptor； Progesterone receptor

贵州省科技厅中药现代化科技产业研究开发专项项目[黔科合中药字(2013)5015号

R737.33

A

1000-744X(2016)10-1028-04

2016-07-11)

#均为本课题主要负责人

△通信作者,E-mail:670082381@qq.com