蚯蚓水解液对草莓白粉病的抑制效果初探

2017-01-04李国雷韩东道

浙江农业科学 2016年12期

黄宇，李国雷，廖敏*，韩东道，张楠，陈娜

（1.浙江省亚热带土壤与植物营养重点研究实验室，浙江杭州 310058；2.象山县农业技术推广中心，浙江象山 315700；3.浙江大学环境与资源学院，浙江杭州 310058；4.宁波龙兴生态农业科技开发有限公司，浙江象山 315700）

蚯蚓水解液对草莓白粉病的抑制效果初探

黄宇1，3，李国雷1，2，廖敏1，3*，韩东道4，张楠1，3，陈娜1，3

通过蚯蚓水解液对草莓白粉病孢子抑制及田间防效试验，探讨对草莓白粉病的抑制潜力。结果表明，蚯蚓水解液对草莓白粉病菌分生孢子萌发具有明显的抑制作用，对草莓白粉病菌孢子萌发的EC50为总氨基酸21.81 mg·L-1。田间防效表明，在草莓白粉病发病期，连续3次喷施蚯蚓水解液，草莓白粉病能被有效控制，防效为80.7%～90.0%，蚯蚓水解液对草莓白粉病的田间防效的喷施浓度以50～100倍液较为适宜。同时蚯蚓水解液的使用不会对草莓的生长发育产生不良影响，反而是促进草莓生长发育，对有益生物也无不良影响，说明蚯蚓水解液在草莓生产上具有很好的防病和促进生长的应用前景。

蚯蚓水解液；草莓白粉病；抑制效果

草莓白粉病是因子囊菌亚门专性寄生真菌羽衣草单囊壳菌（Sphaerothecamacularis）侵染造成，是草莓生产中一种常发性病害，在世界各地均有分布［1-3］。我国南方一般10月下旬至11月上旬始发，12月至翌年4月为发生高峰期。为害导致草莓幼果停止发育，果面覆盖一层白粉，随着病情的加重，草莓果实品质变差，甚至腐烂变质，失去商品价值［4］。该病害已成为草莓生产主要障碍因子，给种植户造成严重的经济损失。

草莓果实一般以直接入口鲜食为主，对果实农药残留限量要求严格，目前生产上防治草莓白粉病常用的化学农药如腈菌唑、百菌清、粉锈宁等，易造成农药残留［5］，同时由于多年的连续使用，使病菌产生抗性，造成防效下降。因此，寻找高效、安全的白粉病真菌抑制剂是草莓产业发展亟须解决的一个问题。

蚯蚓是分解腐熟废弃有机物效率最高的生物，在陆地生态系统中占有重要地位，不但药用价值大，而且蛋白质含量高，约占鲜质量的8%～10%，占干重的56%～66%。正常情况下，蚯蚓体内含有低量的抗菌肽。孙振钧［6］通过热处理、超滤和分子筛等方法，从蚯蚓体液中纯化得到相对分子量低于10 000的抗菌肽，发现其具有很强的抑菌活性，且抗菌谱广，热稳定性较强。张希春等［7］研究发现，蚯蚓体内存在多种抗菌成分，特别是分子量较小的成分中含有性质有别的2种及以上的抗菌肽类成分。贾久满等［8］研究发现，蚯蚓水解液对大肠杆菌具有很好的抑制效果，这一现象在李彦青等［9］研究中也得到验证，这是蚯蚓水解液保留了抗菌肽的活性，同时还新增了有抗菌潜力的系列小分子肽缘故。可见，含有抗菌肽的蚯蚓水解液可作为一种新型的安全抑菌剂加以开发利用。

蚯蚓消化道有10多种蛋白水解酶，这些酶类对蚯蚓蛋白有较强的水解活性。武金霞等［10-11］研究发现，利用蚯蚓自身水解酶分解蚯蚓蛋白质，可获得较高营养价值和富含生物活性物质的蚯蚓水解液。笔者研究也发现，其成分主要为18种氨基酸和少量短肽，其中氨基酸占85%，短肽和小分子蛋白质占12%～15%［12］。目前，蚯蚓水解液利用研究主要集中在氨基酸叶面肥生产原料，或作为动物养殖的营养液利用方面，利用其含抗菌肽活性因子控制作物微生物病害方面的研究等未见报道。本研究通过初步探讨蚯蚓水解液对草莓白粉病菌的抑制效果，旨在为防治草莓白粉病寻找高效、安全的抑制剂，解决草莓产业发展的瓶颈制约问题，同时也为提高蚯蚓资源的附加值利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌种

供试草莓白粉病菌采自于象山县东陈乡东塔村的宁波龙兴生态农业科技开发有限公司的大棚草莓白粉病发生的果实上，采集后在浙江大学实验室制成孢子悬浮液备用。

1.2 蚯蚓水解液制备

选用大平2号蚯蚓，洗净并吐出体内的食物残渣。称取鲜蚯蚓500 g，用高速组织捣碎机捣碎，在pH 7.0、鲜蚯蚓与水重量比为1∶1.5、温度50℃的条件下反应48 h，取粗过滤液在4 500 r·m in-1下离心10 min，取上清液，封样备用。

1.3 处理设计与测定方法

1.3.1 抑制率测定

通过测定蚯蚓水解液对草莓白粉病菌孢子萌发抑制率来确定抑菌效果［13］。将制备好的蚯蚓水解液稀释不同倍数，与草莓白粉病菌孢子悬浮液混合，分别配制成含蚯蚓水解总氨基酸12.0、24.0、48.0、96.0和192.0 mg·L-1的草莓白粉病菌孢子悬浮液的混合液，以灭菌水配制成的草莓白粉病菌孢子悬浮液为对照，各取1滴（约0.25 m L）分别置入双凹载玻片上，每处理重复3次；将凹面朝下，置于铺有吸水滤纸的灭菌培养皿中，放入25℃培养箱中保温培养，24 h后于光学显微镜下随机选择3个视野观察，每个视野随机检查100个孢子，记录孢子的萌发情况，凡孢子的芽管超过孢子直径一半时即判为萌发孢子，计算萌发率和抑制萌发率以及EC50。

1.3.2 处理设计

田间试验于2015年3月15日至4月13日在宁波龙兴生态农业科技开发有限公司草莓大棚内进行，草莓品种为红颊。该大棚历年发生白粉病较为严重，施药时正处于白粉病发病初期，少数果实开始发病。试验共设6个处理：蚯蚓水解液50倍稀释液，蚯蚓水解液100倍稀释液，蚯蚓水解液200倍稀释液，蚯蚓水解液400倍稀释液，10%苯醚甲环唑水分散颗粒剂600倍稀释液（防治草莓白粉病常用化学农药），清水对照（CK）。每处理重复3次，共18个小区，每小区面积20 m2，小区随机区组排列。喷施时间第1次3月15日，第2次3月22日，第3次4月1日，采用背负式喷雾机喷施，均匀喷洒在草莓植株叶的正反面及幼果果面，每小区喷施1.5 L药液。

1.3.3 调查方法和分级标准

第1次喷施前（3月15日）调查病情基数，第1次喷施后7 d（3月22日）、第2次喷施后10 d（4月1日）、第3次喷施后12 d（4月13日）调查发病情况和防治效果。每小区对角线5点取样，每点取5株，每株调查所有果实，以每个果实上病斑面积占整个果实的百分比进行病情分级。病害分级如下［14］：0级，叶片、果实无病；1级，病斑面积占整个叶、果面积的5%以下；3级，病斑面积占整个叶、果面积6%～15%；5级，病斑面积占整个叶、果面积16%～25%；7级：病斑面积占整个叶、果面积26%～50%；9级：病斑面积占整个叶、果面积50%以上。同时，每次调查病害时观察草莓植株生长情况，考查蚯蚓水解液的安全性和促进生长情况。

根据病害调查结果计算病情指数和防治效果，采用邓肯氏新复极差法（DMRT）进行数据统计分析。

病情指数=100×［（各级病叶病果数×病害级别数）］/（调查总叶总果数×9）；

防治效果/%=100×（1—对照区喷施清水前病情指数×处理区喷施后病情指数÷对照区喷施清水后病情指数÷处理区喷施前病情指数）。

2 结果与分析

2.1 对草莓白粉病菌孢子萌发的影响

由表1可知，蚯蚓水解液对草莓白粉病菌孢子的萌发具有明显的抑制作用，且随着蚯蚓水解液浓度的增加抑制作用增强。经对蚯蚓水解液对草莓白粉病菌孢子萌发的影响数据进行回归分析，得出蚯蚓水解液对草莓白粉病菌孢子萌发抑制率的回归方程，即：Y=0.125 5X+47.263，相关系数为r= 0.961 1，式中Y为萌发抑制率（%），X为蚯蚓水解液总氨基酸浓度（mg·L-1），可见蚯蚓水解液对草莓白粉病菌孢子萌发抑制率与蚯蚓水解液总氨基酸浓度存在良好的正相关关系。依据上述回归方程，可推算出蚯蚓水解液对草莓白粉病菌孢子萌发抑制率的半最大效应浓度（EC50）值，即EC50为总氨基酸21.81mg·L-1，可见蚯蚓水解液对草莓白粉病菌孢子萌发的抑制效果明显，这主要是由于蚯蚓水解液中含有一定量抗菌小分子肽之故［6-8］。因此，蚯蚓水解液除了可提供草莓氨基酸营养之外，还具有对白粉病菌等良好的抑制效果，又可能成为替代防治草莓白粉病化学农药的环境友好型药剂，具有一定市场开发前景。

2.2 对草莓白粉病的田间防效

从表2可知，第1次施蚯蚓水解液之后的第7天考查，蚯蚓水解液对草莓白粉病的防效随喷施浓度的增加而提高，蚯蚓水解液50、100、200和400倍稀释液的平均防效分别为74.5%、68.6%、62.1%和58.0%。其中，100倍稀释液防效与苯醚甲环唑化学农药的防效无显著差异，而200倍和400倍稀释液防效低于化学农药，50倍稀释液防效高于化学农药，这可能是由于随着蚯蚓水解液稀释倍数的增加，单位数量内抗菌小分子肽等生理活性物质浓度降低，导致抗菌效果下降的原因所致［6-8］。第2次施蚯蚓水解液后的第10天考查，蚯蚓水解液50、100、200和400倍稀释液的平均防效分别为85.7%、81.8%、79.1%和76.6%，这种趋势与第1次施蚯蚓水解液后的第7天考查结果相同。第3次施蚯蚓水解液后的第12天考查，蚯蚓水解液50、100、200和400倍稀释液的平均防效分别为90.0%、83.8%、81.8%和80.7%，防效趋势仍与第1和2次施蚯蚓水解液后的考查结果相同。由此可见，在草莓白粉病初发期，连续喷施蚯蚓水解液3次后，草莓白粉病的病情指数大幅下降，而空白对照区白粉病发生日趋严重。试验结果还表明，蚯蚓水解液的稀释倍数应控制在50～100倍，以保证优于苯醚甲环唑化学农药的防治效果。此方法值得在草莓生产上推广应用，防止直接入口鲜食水果因农残超标危害身体健康。

表1 蚯蚓水解液对草莓白粉病菌孢子萌发的影响

2.3 对草莓生长安全性影响

在每次调查病害时，目测蚯蚓水解液对草莓叶片和幼果等生长发育情况的影响，以判断其安全性。在整个试验过程中，喷施蚯蚓水解液的处理区未发现草莓的茎叶、花和果实有任何异常药害症状发生。相反，与对照和喷施化学农药的处理区相比，喷施蚯蚓水解液的处理区植株长势更好，叶片颜色更深，果实颜色更鲜艳。

由表3可知，随着蚯蚓水解液喷施浓度提高和次数增加，草莓近似叶面积有随之增加的趋势，且这一趋势随着时间的延长进一步得到强化，而喷施化学农药的处理区近似叶面积与对照无显著差异，这可能因为蚯蚓水解液本身是一种氨基酸叶面营养肥［15-17］，可为植株提供氨基酸和微量元素，促进植物生长，达到药肥一体之效果。同时，也未发现放养的授粉蜜蜂有异常死亡现象，说明在草莓上喷施蚯蚓水解液对有益昆虫是安全的，在草莓生产上具有很好的应用前景。

表2 蚯蚓水解液对草莓白粉病田间防效

表3 不同浓度蚯蚓水解液对草莓近似叶面积的影响

3 小结

蚯蚓水解液对草莓白粉病菌分生孢子萌发具有明显的抑制作用，其抑制孢子萌发的EC50为总氨基酸21.81 mg·L-1。田间试验结果表明，在草莓白粉病初发期，连续喷施蚯蚓水解液3次，防效在80.7%以上，如选用适宜喷施浓度50～100倍且连续喷施3次，防效可达83.8%～90.0%。同时蚯蚓水解液还有促进草莓生长发育的作用，对有益生物无不良影响，对以鲜食为主的草莓生产有很好的推广应用价值。

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