上海市番茄溃疡病的确诊及其防控对策

陈 磊，罗金燕，赵玉强，余 慧，姚红梅

（上海市农业技术推广服务中心，上海 201103）

上海市番茄溃疡病的确诊及其防控对策

陈 磊，罗金燕，赵玉强，余 慧，姚红梅

（上海市农业技术推广服务中心，上海 201103）

番茄溃疡病是由密执安棒形杆菌密执安亚种（Clavibactermichiganensis subsp.michiganensis）引起的番茄最具毁灭性病害之一，在松江区3个大棚内发现可疑番茄病株。大棚内采集的发病植株经南京农业大学病原物分离培养和PCR检测，检测出番茄溃疡病菌。为进一步确认，笔者对分离到的菌株进行了致病性测定，对接种病原物进行了再分离，经专化性免疫试纸条检测和PCR检测，确定为番茄溃疡病菌。同时，总结出一套适用于上海的综合防控措施。

番茄溃疡病；致病性测定；免疫试纸条检测；PCR检测；防控措施

番茄溃疡病是由密执安棒形杆菌密执安亚种（Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis，Cmm）引起的番茄最具毁灭性病害之一，既是我国进境植物检疫对象，又是全国农业植物检疫对象。番茄幼苗至结果期均可发生溃疡病，主要表现为叶片凋萎或蜷缩，似缺水状，茎内部变褐，并向上下扩展，后至中空，最后下陷或开裂呈溃疡状，茎略变粗，生出许多不定根，严重时全株枯死。在切开病株时可发现中间呈褐色腐烂，湿度大时，茎秆中还会溢出白色菌脓。此病特有的症状为病果表面产生鸟眼状坏死斑，称为“鸟眼斑”［1-3］。该病自从1909年首次在美国温室番茄上发现以来，现已广泛分布于美国各番茄产区，并逐渐成为世界性病害。1943—1946年期间，该病在英国大流行，使番茄罐头工业受到严重影响。1991年法国因该病番茄减产20%～30%［4］。

国内有关番茄溃疡病的记载始于1954年，当时在大连市场上采集到2个症状颇似溃疡病的番茄果实［5］。李明远等［6］于1980年6月在北京首次发现此病（朝阳太阳宫公社八队病株率13%），因受条件所限，未能确认病因，至1986年初才正式报道北京发生。随后，山西、内蒙古、辽宁、黑龙江、新疆、安徽、天津、广西、江苏、贵州、河南等地区都相继报道发生［4，5，7-15］。2014年6月上海市农业植物检疫人员在松江区3个大棚内发现可疑番茄病株，发病面积1 000 m2。大棚内采集的发病植株经南京农业大学病原物分离培养和PCR检测，检测出番茄溃疡病菌，这是上海市首次发现番茄溃疡病疫情。为进一步确认，笔者对分离到的菌株进行了柯赫氏法则验证。疫情发生后，上海市农业技术推广服务中心在上海市范围进行普查，未在其他地方新发现疫情，但松江区发生该病的3个番茄大棚损失率均在50%以上。同时，由笔者拟定的番茄溃疡病的处置意见和防控技术方案指导开展相关防控处置工作，疫情处置近两年来，上海市未再发生番茄溃疡病，由此总结出一套适合上海地区推广的综合防控措施。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 主要试剂和试剂盒

番茄溃疡病菌检测试纸条购自美国Agdia公司，细菌DNA提取试剂盒购自TIANGEN公司，PCR试剂购自TaKaRa公司，引物由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。

1.1.2 供试细菌菌株

番茄溃疡病菌标准菌株BX由中国农业大学提供，菌株SH1406由南京农业大学从采自松江区新浜镇的发病番茄植株上分离得到。

1.1.3 供试番茄

致病性测定的供试番茄品种为合作908（已报道为感病品种）［3］，购自上海长种番茄种业有限公司。

1.2 方法

1.2.1 常规细菌学鉴定

革兰氏染色反应采用结晶紫草酸铵染色法，氧化酶试验、过氧化氢酶试验、明胶液化试验参照常规的植病研究方法［16］。

1.2.2 过敏性反应和致病性的测定

将待测菌株BX、SH1406在YDC固体培养基平板上25℃培养72 h后，再用无菌ddH2O配制成108～109CFU·m L-1的菌悬液。采用打顶法［17］接种于播种后培育21～28 d的2～3片真叶期番茄幼苗（播种前种子用0.01%醋酸溶液浸泡消毒处理24 h），每菌接12株幼苗，以无菌ddH2O为空白对照（CK）。接种后植株置于人工气候箱生长，气候箱从7：30—18：30提供光照，且温度保持在30℃，其余保持在24℃。接种后7～21 d观察番茄上的发病情况。同时用菌悬液注射烟草叶片，接种36～54 h后观察烟草叶片接种处有无过敏性反应（Hypersensitive Reaction，HR）。

1.2.3 发病植株病原菌的再分离及检测鉴定

病原菌的再分离与纯化。选取显症植株，剪取病部1～2 cm茎段，置于灭菌后的培养皿内加入无菌水200μL，挤压出茎部组织液，用接种环蘸取组织液在LB培养基上画线分离培养，置于25℃下培养3～4 d，根据菌落形态选择淡黄色的单菌落，在YDC培养基平板上纯化。

专化性免疫试纸条检测。使用从美国Agdia公司购买的检测Cmm专用的免疫试纸条，对发病植株进行检测，以是否出现阳性反应检测线作为判断依据。

PCR检测。对病原菌的再分离与纯化中分离纯化的细菌在YDC液体培养基中进行培养，提取DNA。按照Dreier等［18］和Cho等［19］报道的番茄细菌性溃疡病菌特异性引物Cmm5/Cmm6（引物序列：Cmm5为5′-GCGAATAAGCCCATATCAA-3′；Cmm6为5′-CGTCAGGAGGTCGCTAATA-3′）和Cmm 141F/Cmm141R（引物序列；Cmm141F为5′-CAG GCGTCCGTCGGTGAGGTGGTC-3′；Cmm141R为5′-GCGGGAGAGCGGTGCGGGAATG-3′）分别进行PCR扩增。反应体系为10×PCR Buffer（Mg2+plus）2.5μL，2.5 mmol·L-1dNTP 2μL，5U·μL Taq DNA聚合酶0.2μL，上、下游引物（20μmol·L-1）各0.5μL，模板DNA 1μL，无菌ddH2O补充至25μL。反应条件参照相关文献［18-19］。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳和溴化乙啶（EB）染色后用凝胶成像系统分析，观测是否得到614和141 bp的特异性扩增产物。

2 结果与分析

2.1 生理生化测定

对菌株SH1406进行4项生理生化测定，结果显示与标准菌株BX一致，即革兰氏染色反应阳性，氧化酶试验反应阴性，氧化酶试验反应阳性，明胶液化能力较弱。

2.2 过敏性、致病性测定

通过过敏性反应测试，菌株SH1406与菌株BX一样可激发烟草的HR（过敏性）反应（图1）。接种7 d后观察，所接种的番茄幼苗未显现明显溃疡病症状；接种后14～21 d观察，2个菌株接种的幼苗均不同程度出现子叶萎蔫、茎坏死、植株死亡等典型细菌性溃疡病症状（图2），表明菌株SH1406确为番茄溃疡病菌。

图1 烟草过敏性反应检测结果

2.3 病原物再分离和检测

通过LB和YDC培养基分离纯化显症植株表明，从接种的病株上能够再次分离纯化获得培养性状与BX和SH1406一致的菌落，经纯化后的分离物在YDC培养基上呈黄色黏稠状菌落。而从无菌水接种处理的幼苗上未能分离获得培养性状与BX和SH1406相似的菌落。免疫试纸条检测结果显示表明，BX和SH1406接种处理的病株能够使专化性试纸条呈阳性反应，CK处理呈阴性反应（图3）。用特异性引物Cmm5/Cmm6和Cmm141F/ Cmm141R分别对从接种的病株上获得分离物的DNA进行PCR扩增，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳后观察结果，可见到特异性的614和141 bp扩增片段（图4）。

图2 打顶接种21 d发病结果

图3 免疫试纸条检测结果

图4 PCR电泳检测结果

3 综合防控措施

对松江新浜新发生番茄溃疡病的3个大棚立即进行封锁，及时拔除了番茄植株并就地堆放在大棚内，待植株晒干后集中进行深埋，同时对栽培设施进行消毒处理，防止该病害的扩散蔓延。根据该病的发生规律和上海市番茄的种植情况，提出以下防控策略。

严格植物检疫。番茄溃疡病是典型的种传病害，在番茄繁（育）种过程中须严格执行产地检疫，严禁从疫情发生区向非疫区调种。对调入的种子、秧苗、果实等要加强检疫复检，严禁带菌种子销售。对种植区加强普查和监测，一旦发现疫情，及时向当地植物检疫机构报告，并采取有效的控制封锁措施。

建立无病留种田。种子繁育时，要选择无病田块，开展田间检验，防止生产带菌种子。

种子消毒处理。温汤浸种：先将种子在凉水中浸泡10 m in，捞出后将种子放入55℃温水中浸30 min，不断搅拌，并随时补充热水。药剂浸种：选用0.6%醋酸溶液浸种24 h，或用72%农用链霉素2 000倍液浸种2 h，或用1.5%次氯酸钠浸种30～40 m in，取出冲净晾干后催芽。干热处理：将充分干燥的种子放入70℃恒温箱中灭菌72 h，此法效果显著。

加强田间管理。选择未种过茄科蔬菜的地块作为苗床，避免大水漫灌，采用滴灌或渗灌，防止病菌传播。避免露水未干时进行整枝打杈等农事操作，栽培管理过程中减少对番茄的机械伤害，雨后及时排水，一旦发现番茄溃疡病病株，立即拔除病株及病残体，集中带离棚室进行深埋，降低菌源和损失。

高温闷棚土壤消毒。选择夏季温度较高的时期，密闭温室大棚，可杀死土壤中残留的病菌，防止病害传播。清除大棚内病残体和田间杂草后，每667 m2均匀撒施1 000 kg猪粪等腐熟或半腐熟有机肥和50 kg碳酸氢铵，翻耕整地后灌大水至土壤充分湿润后，覆盖地膜，封闭大棚，保持棚内高温高湿状态3周。

轮作倒茬。种植番茄等茄科作物要与非茄科植物实行轮作倒茬3年以上。

药剂防治。在发病初期，可选用72%农用链霉素4 000倍液和77%氢氧化铜（可杀得）500倍液，对番茄地上部植株进行喷药，隔7～10 d喷1次，连续施药2～3次，以彻底消灭病菌。

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（责任编辑：张瑞麟）

S436

：B

：0528-9017（2016）12-2054-04

文献著录格式：陈磊，罗金燕，赵玉强，等.上海市番茄溃疡病的确诊及其防控对策［J］.浙江农业科学，2016，57（12）：2054-2057.

10.16178/j.issn.0528-9017.20161241

2016-06-22

上海市市级农口系统青年人才成长计划（沪农青字（2015）第4-7号）；上海市科技兴农重点攻关项目（沪农科攻字（2014）第7-3-1号）

陈 磊（1982—），男，上海人，农艺师，硕士，从事植物疫情监测与防控工作，E-mail：chenlei200524@126.com。