无糖基化修饰GLP-1-Fc(N126A)在酵母中的表达、纯化

乔晓芳， 王春艳， 顾宝华 ， 田庆南1,

(1.郑州大学 药学院 河南 郑州 450001; 2.安阳市城乡一体化示范区食品药品监督管理中心 河南 安阳 455000； 3.郑州大学 生命科学学院 河南 郑州 450001)



无糖基化修饰GLP-1-Fc(N126A)在酵母中的表达、纯化

乔晓芳1,2， 王春艳3， 顾宝华3， 田庆南1,3

(1.郑州大学 药学院 河南 郑州 450001; 2.安阳市城乡一体化示范区食品药品监督管理中心 河南 安阳 455000； 3.郑州大学 生命科学学院 河南 郑州 450001)

胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)是一种肠促胰岛素激素，具有很好的综合降糖效果，但其在血浆中的半衰期只有短暂几分钟,限制了GLP-1在临床方面的应用.为延长GLP-1的半衰期，合成了GLP-1-Fc融合基因，将N-糖基化作用的受体天冬酰胺突变为丙氨酸，构建了无糖基化修饰的GLP-1-Fc(N126A)融合表达载体，利用酵母表达系统成功表达了GLP-1-Fc(N126A)融合蛋白，并利用rProteinA获得了高纯度融合蛋白.

胰高血糖素样肽-1； Fc融合蛋白； 酵母表达

0 引言

胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptid-1, GLP-1)是由直肠、结肠和远端回肠的L细胞分泌、由前胰升血糖素衍生的一种多肽激素[1].GLP-1的肠促胰岛素作用依赖于血浆中的葡萄糖浓度，在高血糖的情况下，可促进胰岛素的分泌.因此，GLP-1在II 型糖尿病的治疗中具有重要的价值[2].但是，GLP-1在血浆中极易被降解，半衰期较短，仅有3～5 min[3-4]，严重限制了GLP-1在临床方面的应用.因此，利用基因工程的方法构建能延长GLP-1半衰期的GLP-1类似物是解决这一问题的良好方法.本研究将GLP-1与Fc片段融合，以延长GLP-1的半衰期[5-6].

目前，人们常用的蛋白表达系统有大肠杆菌表达系统、哺乳动物表达系统和酵母表达系统.酵母菌表达系统作为真核表达系统，具备了原核生物快速繁殖、易于培养的特点，同时能够分泌表达，完成蛋白质修饰[7-8].但是，在酵母表达修饰系统中，糖基化修饰能引起免疫原性，降低半衰期，因此如何利用酵母表达系统获得无糖基化的融合蛋白是进一步优化GLP-1表达的难点.

本研究通过构建GLP-Fc融合表达载体，利用毕赤酵母GS115表达系统，获得了GLP-Fc融合表达蛋白，并通过突变N-糖基化位点N126,进一步获得无糖基化修饰融合蛋白，为获得半衰期长、免疫原性低、生产成本低的GLP-1融合蛋白提供了一种有效途径.

1 材料与方法

1.1 材料

菌株:PPIC3.5k质粒、大肠杆菌XL-10、毕赤酵母GS115、GS115-DT-6，均由本实验室提供和保存.

1.2 试剂

rTaq酶、25 mmol/L dNTPs、T4 DNA连接酶、DL2000DNA分子量marker、DL5000DNA分子量marker；限制性内切酶(NotI、BamHI)为NEB公司产品；pfuDNA聚合酶购自上海生工公司；GoldView TM核酸染料购自Biorule；质粒小提试剂盒、DNA纯化试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自天根生物有限公司；无缝克隆试剂盒购自上海近岸科技有限公司.

1.3 实验方法

1.3.1 质粒表达载体的构建 GLP-1-Fc基因由上海生工生物工程有限公司合成，在基因的5’端添加XhoI的酶切位点，3’端添加TAA终止密码子和NotI酶切位点.利用重叠延伸PCR，构建aF-GLP-1-Fc基因片段.分别利用BamHI-HF和NotI-HF双酶切pPIC3.5k质粒及目的基因，并进行纯化回收.经T4 DNA连接酶连接后，转化大肠杆菌XL-10，经菌落PCR验证后，抽提质粒进行基因测序.

1.3.2 GLP-1-Fc(N126A)的构建 突变体表达载体构建主要采用QuikChange 定点突变技术.以Ala的密码子序列为中心、设计上下游引物.对合成引物进行磷酸化，利用磷酸化后引物进行QuikChange PCR，经DpnI 酶切后转化XL-10.挑选菌落进行菌落PCR验证，并提取质粒进行序列分析.

1.3.3 GLP-1-Fc(N126A)的表达SaCI单酶切重组质粒pPIC3.5k-aF-GLP-1-Fc，对质粒进行线性化.利用乙醇沉淀法纯化线性化后的质粒.通过电转化转入毕赤酵母GS115中，经菌落PCR验证后，挑取阳性菌落接种于BMGY培养液中220 rpm、29 ℃培养约24 h.24 h培养结束后，向培养基中添加100%甲醇至其终浓度为0.5%，开始蛋白的诱导表达.加入浓度为0.5%的甲醇诱导6 d.取样的菌液按照12 000 rpm离心10 mim后,将上清和沉淀分开，保存至-20 ℃冰箱中.

1.3.4 GLP-1-Fc(N126A)的分离纯化 HiTrap rProtein A FF预装柱及KTAprimeTMPLUS蛋白纯化系统对融合蛋白进行亲和层析.结合缓冲液采用20 mmol/L磷酸钠(pH 7.0)缓冲液，洗脱液采用0.1 mol/L柠檬酸钠(pH 3.0)缓冲液.

1.3.5 Western blot检测目的蛋白 将纯化获得的目的蛋白进行SDS-PAGE电泳，待电泳结束后，取出凝胶，参照蛋白marker，切下目的蛋白应在部分，做好标记后放在1×电转液中浸泡5 min.经转膜、封闭后，按1∶8 000用封闭液稀释羊抗人IgG Fc(HRP)抗体，将NC膜转入其中，放在脱色摇床上室温孵育2 h.将NC膜取出洗膜30 min后，在暗室内，按照ECL试剂盒说明书取A液与B液各1 mL在EP管中充分混匀后，均匀加到NC膜上，孵育1.5 min，曝光并保存图片.

2 结果

2.1 aF-GLP-1-Fc表达载体的构建、鉴定

提取含有已经优化过的信号肽的酵母基因组，PCR获得信号肽aF，并对PCR产物进行纯化，纯化的DNA片段大小为288 bp；目的基因GLP-1-Fc由生工生物公司合成，基因大小为914 bp.通过重叠延伸PCR的方法构建目的基因aF- GLP-1-Fc，片段大小为1 202 bp.利用BamHI-HF和NotI-HF双酶切pPIC3.5k质粒及目的基因片段，并通过T4连接酶将目的基因连入表达载体.重组质粒利用BamHI-HF和NotI-HF双酶切鉴定(如图1)，大小正确，同时，DNA测序结果分析读码框正确、未发生移码.

2.2 GLP-1-Fc(N126A)的构建

N-糖基化的第一步是将14C的核心寡聚糖添加到新形成的多肽链的天冬酰胺受体上，其特征氨基酸的序列为Asn-X-Ser/Thr.通过分析GLP-1-Fc序列，第126位天冬氨酸为融合蛋白N-糖基化位点.因此，本研究为获取无糖基化修饰蛋白，构建了GLP-1-Fc(N126A)突变体(如图2).突变体构建采用QuikChange 定点突变技术，引物磷酸化后，通过QuikChange PCR，转化XL-10，经酶切验证、测序分析后挑取阳性克隆进行后续培养、蛋白纯化.

M：DL5000；1～2：提取的阳性质粒

图1 af-GLP-1-Fc重组质粒的双酶切鉴定
Fig.1 The double digests analysis of af-GLP-1-Fc construction

A：QuikChange PCR；B：aF-GLP-1-Fc与aF-GLP-1-Fc(N126A)序列比对

2.3 GLP-1-Fc(N126A)的诱导表达

将含有GLP-1-Fc(N126A)表达载体电转化毕赤酵母.以BMGY作为培养液经甲醇诱导6天后取上清，SDS-PAGE检测，30～40 kD处含有诱导蛋白表达条带(如图3).为了进一步确认融合蛋白的表达，利用抗Fc抗体对上清液进行Western blot实验检测，ECL显色进一步确认表达蛋白中含有Fc片段(如图4).

图3 SDS-PAGE电泳检测GLP-1-Fc(N126A)融合蛋白的表达Fig.3 SDS-PAGE analysis the expression of GLP-1-Fc(N126A) fusion protein

图4 Western blot检测GLP-1-Fc(N126A)融合蛋白的表达Fig.4 Western blot analysis of the GLP-1-Fc(N126A) fusion protein expression

2.4 GLP-1-Fc(N126A)的表达和纯化

rProtein A亲和层析柱能够特异结合Fc片段蛋白，如图5所示，利用rProtein A亲和层析柱进行一次纯化即可获得单一的洗脱峰(473.5 mL).将洗脱峰进行SDS-PAGE检测，GLP-1-Fc(N126A)融合蛋白纯度为80%(如图6).

图5 rProtein A亲和层析纯化GLP-1-Fc(N126A)融合蛋白色谱图 Fig.5 Affinity chromatography of GLP-1-Fc(N126A)with rProtin A

图6 SDS-PAGE检测GLP-1-Fc(N126A)的纯化结果Fig.6 SDS-PAGE analysis the expression of GLP-1-Fc(N126A) fusion protein

3 讨论

近几年，II型糖尿病发病率急剧提高，医学及分子生物学领域越来越关注II型糖尿病的治疗，使其成为科研工作者研究的热点问题.GLP-1具有促进胰岛素分泌、抑制胰高血糖素合成、减退食欲、减少食物吸收等作用，在降血糖的同时还可以降低体重、副作用不明显，所以其在治疗II型糖尿病方面存在巨大潜力[9-11].

本研究将GLP-1与人的Ig4蛋白基因进行融合，并构建酵母表达载体(如图1所示)，通过增加融合蛋白的分子量，降低肾脏清除融合蛋白的速率，并利用Fc的循环受体(ecycling receptors，FcRn)使得重组蛋白能循环利用，进一步延长重组蛋白在血浆中的作用，从而延长融合蛋白的半衰期.美国FDA已经批准上市的融合蛋白GLP-1-Fc采用细胞表达系统，生产成本高，本研究选择易于大规模培养、能够进行分泌表达的毕赤酵母作为表达系统，首先从发酵条件上极大程度减少了生产成本.此外，酵母表达系统存在糖基化修饰，容易表达糖蛋白进而缩短半衰期、增加免疫原性[12-13]，通过对融合蛋白序列分析发现，GLP-1-Fc仅存在N126一个N-糖基化位点.为减少糖基化修饰的影响，本研究进一步将N126位点天冬氨酸成突变为了丙氨酸(如图2所示)，通过改变N-糖基化的特征序列避免N-糖基化的形成，进一步减少了免疫原性.融合蛋白在酵母中经甲醇诱导6天后在发酵上清中存在显著过表达条带(如图3所示)，表明融合蛋白胞外表达成功，简化了胞内表达蛋白纯化所需步骤.发酵上清在液相色谱经ProteinA纯化中仅出现单一峰，仅经一步纯化即可获得高纯度产物(如图5、6)，所需纯化工艺简单，适合工业化生产.综上所述，本研究从表达和纯化两方面减少了GLP-1-Fc生产成本，为国内GLP-1的新药研发打下了基础.

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(责任编辑：王浩毅)

Expression and Purification of Non-glycosylated Glp-1-Fc(N126A)
Fusion Protein in Yeast Expression System

QIAO Xiaofang1,2， WANG Chunyan3, GU Baohua3， TIAN Qingnan1,3

(1.DepartmentofPharmacy,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001,China; 2.CenterofAnyangHigh-
TechZoneFoodandDrugAdministration,Anyang455000,China; 3.SchoolofLifeScience,Zhengzhou
University,Zhengzhou450001,China)

Glucagon-like peptide-1(GLP-1) is a kind of ducdenin, which has good and comprehensive hypoglycemic effect.The GLP-1 was easy to be degraded in plasma. To prolong the half-life of GLP-1, the GLP-1-Fc(N126A) was constructed through mutant N-glycosylation asparagine receptor into alanine. The GLP-1-Fc(N126A) fusion protein was obtained by yest expression system, and was purified by rProteinA.

glucagon-like peptide-1(GLP-1); Fc fusion protein; yeast expression

2016-09-27

国家自然科学基金青年科学基金资助项目(31601867)；中国博士后基金特别资助项目(2016T90674)．

乔晓芳(1977—)，女，河南安阳人，主管药师，主要从事生物医药研究，E-mail:ayqiaoxiaofang@163.com；通讯作者：田庆南(1986—)，男，河南商丘人，讲师，主要从事生物医药研究，E-mail:tqn127@163.com．

乔晓芳，顾宝华，田庆南.无糖基化修饰GLP-1-Fc(N126A)在酵母中的表达、纯化[J] ．郑州大学学报(理学版)，2016，48(4)：86-89．

Q784;Q786;Q789

A

1671-6841(2016)04-0086-04

10.13705/j.issn.1671-6841.2016697