大黄素对急性肺损伤大鼠的肺泡灌洗液中TNF-α IL-1β的影响

朱诗乒 楼雅芳 蔡宛如⋆

·论著·

大黄素对急性肺损伤大鼠的肺泡灌洗液中TNF-α IL-1β的影响

朱诗乒 楼雅芳 蔡宛如⋆

目的评价大黄有效成分大黄素对急性肺损伤（ALI）的保护作用，探讨其防治急性肺损伤的作用机制。方法SD大鼠40只随机分为四组：空白对照组、模型组、溶剂组、大黄素组，每组各10只。采用气管内滴注内毒素法制备ALI大鼠模型，溶剂组腹腔注射脂肪乳，大黄素组腹腔注射的剂量为10mg/kg，在造模前24h，造模，造模后24h内行腹腔注射给药，空白对照组不作任何处理。在造模后48h采集标本，并且行肺组织HE染色，进行肺泡灌洗液中总细胞数及中性粒细胞计数，检测其总蛋白含量及乳酸脱氢酶，采用酶联免疫法检测大鼠BALF中TNF-α、IL-1β的含量。结果相比较与模型组与溶剂组，大黄素组能显著减轻肺间质炎性细胞浸润，肺间质水肿，肺泡壁增厚，肺泡腔破坏程度。且可以降低肺泡灌洗液中的总细胞数和TNF-α、IL-1β（P＜0.05），但其对中心粒细胞比值及总蛋白含量影响不大（P＞0.05）；另外其可以引起BALF中的LDH升高（P＜0.05）。结论大黄素对急性肺损伤存在一定的治疗作用，这可能与其降低肺组织中TNF-α、IL-1β等促炎因子，从而降低肺泡灌洗液中的总细胞数有关，但其可以引起肺泡灌洗液LDH的升高。

急性肺损伤 大黄素 肿瘤坏死因子-α 白介素-1β

急性肺损伤（ALI）/急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是指心源性以外的各种肺内、外致病因素导致的急性、进行性呼吸衰竭。病死率达30%～70%［1-2］。作者前期实验研究已经证实中药大黄或其复方中药制剂可以显著减轻肺损伤大鼠肺泡结构的破坏，炎症细胞的浸润，减轻肺泡间隔水肿出血［3-5］。大黄素是中药大黄的主要活性成分。相关研究证明大黄素可以对脂多糖（LPS）诱导的巨噬细胞炎症反应具有明显的抑制作用。2012年4月至8月作者通过动物实验来评价大黄素对急性肺损伤的保护作用，探讨其防治急性肺损伤的作用机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物 健康雄性SD大鼠40只，清洁级，体重（200±20）g，由浙江中医药大学动物实验中心提供。动物实验合格证号：2011A033。

1.2 药物与试剂 脂多糖（sigma公司进口分装）；异氟烷（鲁南贝特制药有限公司）；炎症因子ELISA试剂盒（美国RND公司进口分装）；98%分析纯大黄素（上海金穗生物科技有限公司）；脂肪乳（250ml：50g大豆油，3g卵磷脂）；TNF-α、IL-1βELISA试剂盒进口分装（联科生物有限公司）；Bradford 法蛋白浓度定量试剂盒（联科生物有限公司）；LDH测定试剂盒（联科生物有限公司）。

1.3 实验仪器 大鼠灌胃器、烧杯、电子天平；液态雾化吸入装置；高速低温离心机；酶标仪；37℃孵育箱；-20℃冰箱；-70℃冰箱；电炉、切片机：Leica2135、自动脱水机：Tissue-Tek Vip、自动包埋机：Tissue-Tek Tec、显微镜：Olympus Bx5040。

1.4 动物分组及模型建立 40只大鼠采用随机数字表法分组：空白对照组、模型组、溶剂组、大黄素组，每组10只。除了空白对照组外，其余各组均进行急性肺损伤造模。造模方法：通过液态雾化吸入装置将异氟烷雾化，雾化麻醉SD大鼠，将老鼠颈部除毛，用碘酒擦拭消毒。在距大鼠环状软骨约0.5cm处作约0.3cm切口，分离气管；将LPS配置成3mg/ml溶液，用1ml针筒吸取LPS溶液，按照1.5mg/kg剂量，缓慢注射入大鼠气管中。然后，迅速缝合切口，再次用碘酒将切口消毒。并将大鼠左右上下摇晃，让LPS溶液均匀分布于SD大鼠肺组织中，约1～2min后，大鼠会复苏。空白对照组进行生理盐水滴注处理。

1.5 给药方法 将大黄素溶解于脂肪乳剂中，配置成1mg/ml溶液，在造模前24h，造模，造模后24h内行腹腔注射给药，给药剂量为10mg/kg。

1.6 标本采集 在造模后48h后，腹腔注射戊巴比妥溶液麻醉大鼠（剂量为3ml/kg），采集标本。（1）支气管肺泡灌洗液（BALF）：打开双侧胸腔，分离气管及肺组织，于气管隆突上方约1cm处作一小切口后插入22号套管针，用无菌手术缝合线进行固定，结扎左上肺主支气管，行右侧及左下侧支气管肺泡灌洗。注入生理盐水3ml，反复抽吸3次，回收BALF约2ml左右，回收率65%～70%，将灌洗后的肺泡液摇匀，抽取10μl后稀释3倍，在细胞计数板上进行肺泡灌洗液总细胞数的计数；将剩余BALF放入离心管中，低速离心机3000r/min离心15min，取上清液，-80℃冰箱保存；将细胞沉淀涂片，进行瑞氏染色，进行细胞分类计数。（2）组织：取左肺上叶分剪三段，用于HE染色。

1.7 实验指标检测及方法 （1）组织病理检查：肺组织经10%福尔马林溶液固定24h后入全自动脱水机脱水、透明、浸蜡。经固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片后进行HE染色，最终经中性树胶封固并在光学显微镜下观察肺组织病理变化。（2）BALF细胞计数：①细胞总数计数：将摇匀后的肺泡细胞灌洗液吸出10μl并稀释3倍，用计数板四大格细胞总数，通过公式计算出BALF液中的细胞总数，计算公式如下：细胞数/ml=四大格细胞总数×4×3÷104。②细胞分类计数：将离心后的细胞沉渣用移液枪吸出约1ml，平铺于载玻片上，待其风干后，进行瑞氏染色，计算其中性粒细胞数、淋巴细胞数及单核细胞比例。（3）大鼠BALF中TNF-α、IL-1β含量：将大鼠BALF放入离心管中，低速离心机3000r/min离心15min，取上清液，-80℃冰箱保存，经解冻后，采用酶联免疫法（ELISA）检测大鼠BALF中TNF-α、IL-1β含量。（4）肺泡灌洗液中总蛋白含量的测定：将大鼠BALF放入离心管中，低速离心机3000r/min离心15min，取上清液，-80℃冰箱保存，经解冻后，采用Bradford 法蛋白浓度定量试剂盒检测大鼠BALF中总蛋白含量。（5）肺泡灌洗液中乳酸脱氢酶（LDH）的测定：将大鼠BALF放入离心管中，低速离心机3000r/min离心15min，取上清液，-80℃冰箱保存，经解冻后，按LDH测定试剂盒说明书，取样本10pl，加入各试剂，混匀后在37℃水浴中保温30s，在340nm处读取初始吸光度，同时开始记时，在精确1、2、3min时，分别读取吸光度，确定每分钟平均吸光度变化（△A/ min），计算样本中LDH的活性。

1.8 统计学方法 采用SPSS 19统计软件。计量资料以（x±s）表示，正态分布数据用One-way ANOVA检验，予以方差齐性检验，进行方差齐性检验后，使用LSD检验进行组间比较；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HE染色镜下观察 （1）空白组：未见明显改变，肺泡结构多数保持完整，肺泡壁无水肿，肺间质少见炎性细胞浸润。（2）模型组：肺间质内大量炎性细胞浸润，肺泡腔内少量炎性细胞，肺间质水肿，肺泡间隔增宽，肺泡腔结构破坏、融合，肺泡腔及肺间质内炎性出血。（3）溶剂组：肺间质内大量炎性细胞浸润，肺泡腔内少量炎性细胞，肺间质水肿，肺泡间隔增宽，肺泡腔结构破坏、融合，肺泡腔及肺间质内炎性出血。与模型组相似。（4）大黄素干预组：肺间质炎性细胞浸润，肺间质水肿，肺泡壁增厚，肺泡腔破坏程度均比模型组有所减轻，各组间比较不明显（见图1）。

图1 肺组织HE染色镜下观察

2.2 各组大鼠BALF总细胞数、N、总蛋白含量、IL-1β、TNF-α、LDH的比较 见表1。

表1 各组大鼠BALF中总细胞数比较（x±s）

3 讨论

ALI是以大量弥漫性炎症细胞肺内浸润、肺微血管通透性增加、肺泡和肺实质内高度水肿及低氧血症为特征的常见临床综合征。ALI的发病机制错综复杂，迄今尚未完全阐明，随着失控的炎症反应引起多脏器功能障碍综合征理论的出现，使人们对ALI的发病机制转向对炎症损伤的认识。细胞因子是有机体产生的小分子可溶性的蛋白质，能够影响机体细胞的行为和特征。可分为促炎因子和抗炎因子，其中TNF-α和IL-1β是炎症损伤中比较常见的促炎因子。

ALI/ARDS中，复杂的细胞因子网络和其他促炎化合物发动并增强了炎症反应，过激的炎症反应给机体带来了不可避免的损伤［6］。其中以TNF-α和IL-1β为著。TNF-α在创伤后炎症中是一具始动和关键性作用的促炎免疫分子，其能聚集激活中性粒细胞（PMN），导致呼吸爆发加剧肺损伤，其主要通过肺泡细胞的溶解，炎症细胞在肺内迁移以及血管内皮损伤等多种途径引起肺损伤［7-9］。而IL-1β与其具有协同作用，其共同作用在炎症早期就能引起肺泡细胞的破坏，炎症细胞在肺泡内的募集，从而加重肺泡蛋白渗出，肺实质的水肿，引起呼吸膜的增厚，另外激活的PMN释放大量氧自由基［10］，直接损伤肺泡上皮及肺血管内皮细胞，导致肺毛细血管破坏，肺泡上皮细胞变性坏死，毛细血管渗漏，血浆及纤维蛋白及肺泡组织内的乳酸脱氢酶（LDH）从毛细血管渗出至肺泡，促成ALI的发生。

前期的研究证实大黄及其中药复方（如芪冬活血饮）可以显著减轻肺损伤大鼠肺泡结构的破坏，炎症细胞的浸润，减轻肺泡间隔水肿出血。其保护机制与减少前炎症因子TNF-α的分泌，增加抗炎因子IL-10分泌，调节抗炎和促炎因子之间的平衡；减少MDA含量、增加SOD含量，具有抗氧化作用有关［3-5］。但其具体中药单体的结果作用尚不明确，大黄素是大黄有效成分中最重要的单体。既往研究认为，大黄素对抗炎、抗肿瘤细胞增殖和转移、抑制肝脏和肾脏纤维化等均有较强的药理作用。研究［11-12］报道，大黄素对胰腺炎的治疗作用是多层面的，除通过诱导胰腺腺胞细胞凋亡、减轻胰腺局部病损作用外，可能还具有诱导PMN凋亡，而发挥其治疗胰腺炎作用。通过诱导PMN凋亡，减少PMN在多种组织器官内的积聚，对于预防或减轻胰腺炎并发SIRS、MODS具有深远意义。

在本资料中，大黄素可以有效降低BALF中总细胞数的含量。另外，其对BALF中中性粒细胞比值及肺泡总蛋白量中均有降低作用，表明其可以有效的减少炎症细胞的募集和肺泡渗出，这主要反映在组织病理学上，可以看到蒿本内酯组大鼠的肺间质炎性细胞浸润，肺间质水肿，肺泡壁增厚，肺泡腔破坏程度得到改善。作者认为，与其能有效降低BALF的促炎因子（TNF-α和IL-1β）有关。相比较与溶剂组，大黄素可以降低BALF中总细胞数的含量，但其不存在统计学差异（P＞0.05），这可能和单体的浓度相关，如增加单体的给药浓度，可能所有组别的均值将会下降，且在统计学上存在差异。另外大黄素在BALF中中性粒细胞比值上虽然无统计学差异，但其均值仍较溶剂组低，在肺泡灌洗液的蛋白含量中也是如此。在BALF的促炎因子中，大黄素无论是对TNF-α，还是IL-1β均存在降低的作用（P＜0.05）；另外，大黄素组可以引起肺泡灌洗液中LDH的升高，且较溶剂组还要高，这一点需要引起关注。因此，大黄素可以通过降低肺泡灌洗液中的总细胞数及TNF-α和IL-1β来治疗急性肺损伤，但其能引起LDH的显著升高。

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ObjectiveIn this study，to explore the rapeutic effect of the Angelica monomer “Emodin”in acute lung injury by animal experiments.Methods40 SD rats were randomly divided into seven groups：control group，model group，solvent group，and Emodin groups.Each group have 10 rats.ALI rat model prepared by Using intratracheal instillation of LPS，the solvent group by intraperitoneal injection of fat emulsion，the monomer groups by intraperitoneal injection of dose 10mg/kg in 24 hours before modeling，modeling，and 24 hours after modeling. Nothing was given in blank control group.Samples were collected 48 hours after modeling，then do lung tissue H & E staining，count the total number of cells and the rato of neutrophil in the bronchoalveolar lavage fl uid. Detect of the total protein content and lactate dehydrogenase，the enzyme-linked immunosorbent assay in BALF and various tissues of TNF-α，IL-1βcontent in BALF are also assay by ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay）.ResultsCompared with the model group and the solvent group，Emodin signifi cantly reduced the infi ltration of pulmonary interstitial infl ammatory cell，edema of interstitial pulmonary，also the thickening of alveolar wall，the alveolar damage. and the total number of cells，TNF-α，IL-1βin bronchoalveolar lavage fl uid（P＜0.05）.But neutrophil ratio and total protein content not affected（P＞0.05）；In addition，it can cause the BALF LDH increased（P＜0.05）.ConclusionThe therapeutic effect of Emodin in acute lung injury may relate its decreasing important pro-infl ammatory cytokines in lung tissue like TNF-α and IL-1βwhich reduce the total number of cells in BALF. But it can cause elevated LDH in BALF.

Acute lung injury Ligustilide Tumor necrosis factor-α Interleukin-1β

国家自然科学基金项目（2012ZGG002）

310007 杭州市中医院呼吸科（朱诗乒 楼雅芳）310005 浙江中医药大学附属第二医院（蔡宛如）

*通信作者