HPLC法测定首乌益智胶囊中大黄素和大黄素甲醚的含量

丁晓彦，刘青，贾元印，赵渤年

(山东省中医药研究院，山东省中药质量标准研究重点实验室，山东 济南250014)



【中药与天然活性产物】

HPLC法测定首乌益智胶囊中大黄素和大黄素甲醚的含量

丁晓彦，刘青，贾元印，赵渤年*

(山东省中医药研究院，山东省中药质量标准研究重点实验室，山东 济南250014)

建立了高效液相色谱法(HPLC)同时测定首乌益智胶囊中大黄素和大黄素甲醚含量的方法。采用C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱，以甲醇-0.1%磷酸水(82：18，V/V)为流动相，检测波长为289 nm，流速为1.0 mL/min，柱温30 ℃。测得大黄素在0.019～0.19 μg(R=0.999 9，n=5)、大黄素甲醚在0.021～0.21 μg(R=1.000 0，n=5)线性关系良好；大黄素和大黄素甲醚的平均回收率分别为98.58%、100.01%，相对标准偏差分别为2.66%、1.15%。研究表明,该方法专属性强、结果准确，可作为同时测定首乌益智胶囊中大黄素和大黄素甲醚含量的方法。

首乌益智胶囊；大黄素；大黄素甲醚；高效液相色谱法；含量测定

首乌益智胶囊主要由制何首乌、益智、黄芪等10种中药组成，具有补肾填精、化瘀通窍的功效，主要用于治疗肾精亏虚、瘀血阻络型血管性痴呆。制何首乌为方中君药，而大黄素和大黄素甲醚是何首乌的主要成分，也是《中国药典》[1]规定的制何首乌的含量测定检测项之一。现代药理实验研究证明，何首乌中蒽醌类成分(AGPMT)具有抗肿瘤和提高免疫功能的作用[2]。其中，大黄素的药理作用有抑制胰酶活性、抑菌、抗炎、免疫调节、保肝利胆、清除自由基、抗氧化、降低血液粘度、抑制血小板聚集、抗肿瘤及治疗急性胰腺炎等[3-5]。

国内有大量关于大黄素含量测定的文献报道，但采用高效液相色谱法测定大黄素和大黄素甲醚含量[6-7]的文献并不多，该类报道中以测定中药成方制剂中二者含量方法为多[8-11]，但因组方、剂型等不同，其测定方法也稍有不同。为了控制首乌益智胶囊的质量，使其在临床使用中更加安全有效，本文采用高效液相色谱法对首乌益智胶囊中的大黄素和大黄素甲醚含量的测定方法进行研究，方法简便、准确，重现性好，为控制本制剂质量提供了一种快速、便捷的科学方法。

1 仪器、试剂与试药

1.1 仪器

高效液相色谱仪(美国Waters， Waters e2695 )；Thermo Syncronis C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5μm)；电子天平(德国Sartorius，BP211D)。

1.2 试剂

盐酸、磷酸、甲醇(提取用)、三氯甲烷、无水硫酸钠为分析纯，甲醇(HPLC测定用)均为色谱纯，水为超纯水。

1.3 试药

大黄素对照品(批号110756-200110)、大黄素甲醚对照品(批号110758-201415)均由中国食品药品检定研究院提供。制何首乌、益智、黄芪等中药饮片购自山东建联盛嘉中药有限公司中药饮片厂，首乌益智胶囊样品为自制3批样品。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

采用Thermo Syncronis C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；检测波长289 nm；流速1.0 mL/min；柱温30 ℃；进样量10 μL。以甲醇-0.1%磷酸水溶液(82:18，V/V)为流动相，理论板数按大黄素峰计算不低于2 500。

2.2 混合对照品溶液制备

分别称取大黄素及大黄素甲醚对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL各含大黄素、大黄素甲醚10 μg的溶液，即得。

2.3 供试品溶液制备

称取装量差异项下本胶囊内容物适量，研细，取约1 g，精密称定，加硅藻土2 g，拌匀，置索氏提取器中，加甲醇100 mL，加热回流3 h。将提取液蒸干，加8%盐酸溶液40 mL使溶解，转移至圆底烧瓶中，加三氯甲烷40 mL，水浴回流2 h，立即冷却，转移至分液漏斗中，分出三氯甲烷层，酸水液层用三氯甲烷提取2次，每次40 mL，合并三氯甲烷液，用水80 mL洗涤一次，三氯甲烷液加无水硫酸钠15 g，振摇5 min，静置30 min，滤过。用少量三氯甲烷洗涤残渣及滤器，合并滤液、洗液，蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。精密量取该溶液1 mL至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得供试品溶液。

2.4 阴性对照溶液制备

按处方组成及比例，剔除制何首乌，称取方中其他药味，按首乌益智胶囊的制备工艺和供试品溶液的制备方法，制得不含制何首乌的阴性对照溶液。

2.5 专属性考察

分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各10 μL,采用高效液相色谱法，按2.1项下的色谱条件进行测定，结果发现，阴性样品在大黄素和大黄素甲醚相同保留时间处无干扰，见图1。

a 大黄素和大黄素甲醚混合对照品；b 首乌益智胶囊样品；c 阴性样品图1 对照品、首乌益智胶囊、阴性样品HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of Shouwuyizhi capsule，control and negative samples

2.6 线性关系考察

取大黄素浓度为9.58 μg/mL、大黄素甲醚浓度为10.26 μg/mL的对照品溶液，进样量分别为 2、5、10、15、20 μL,按上述色谱条件进行测定。以峰面积值为纵坐标，以进样量为横坐标进行回归分析,结果，大黄素进样量在0.019～0.19 μg范围内线性关系良好，回归方程为，Y=6×106X-16 562，R=0.999 9；大黄素甲醚进样量在0.021～0.21μg范围内呈良好线性关系，回归方程为，Y=8×10-7X+0.008 7，R=1.000 0。

2.7 精密度实验

吸取混合对照品溶液，按2.1项下色谱条件，连续进样6次，测定大黄素和大黄素甲醚的峰面积，计算得相对标准偏差分别为0.46%和1.47%。

2.8 重现性实验

取同一批(批号1)胶囊内容物，取样6份，分别制成供试品溶液，注入高效液相色谱仪，测定。计算得到样品中大黄素的平均含量为0.301 5毫克/粒，相对标准偏差为1.87%；大黄素甲醚的平均含量为0.474 9毫克/粒，相对标准偏差为1.98%。

2.9 稳定性实验

取同一批号(批号1)胶囊内容物制成的供试品溶液，分别在0、2、4、8、12 h进样，测定大黄素和大黄素甲醚的峰面积值，共测5次。结果，大黄素的相对标准偏差为2.33%，大黄素甲醚的相对标准偏差为0.89%，这表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.10 加样回收率实验

取已测定含量的供试品(批号1)适量，研细，称取约0.5 g，精密称定，共取6份，精密加入分别含大黄素0.41mg/mL、大黄素甲醚0.40 mg/mL的混合对照品溶液1 mL，按2.3项下方法制备供试品溶液，计算加样回收率。结果大黄素的平均回收率为98.58%，相对标准偏差为2.66%(n=6)；大黄素甲醚的平均回收率为100.01%，相对标准偏差为1.15%(n=6)，测定结果见表1～2。

表1 大黄素加样回收率实验结果Table 1 Experimental results of emondin recovery rate

表2 大黄素甲醚加样回收率实验结果Table 2 Experimental results of emondin monomenthyl ether recovery rate

2.11 样品的测定

分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液各10 μL，进样，测定色谱峰面积，计算各样品中大黄素和大黄素甲醚的含量，样品测定结果见表3。

表3 样品测定结果表Table 3 Determination results of samples

3 讨论

供试品溶液制备方法的确定既参考了《中国药典》何首乌总蒽醌含量测定的制备方法，又结合本样品自身的特点，样品前处理方法在完全提取目标成分的同时，尽量排除制剂辅料及其他成分，使样品测定时免受杂质峰干扰。

在供试品溶液制备方法中，有研究采用不同浓度甲醇或乙醇提取的方法,该方法操作简单。实验前期，也曾考虑采用甲醇回流提取方法制备供试液，但结果显示，没经过水解得到样品的大黄素和大黄素甲醚提取率低，且测定图谱中其他与测定无关成分较多，故最终采用2.3所述方法制备供试液。

实验对大黄素和大黄素甲醚水解时间及温度进行了考察，结果表明，沸水浴回流2 h可实现结合蒽醌完全水解，提取出大黄素和大黄素甲醚。实验对样品检测进行了全波长扫描，发现大黄素和大黄素甲醚在289 nm附近有最大吸收，故选择波长289 nm作为大黄素和大黄素甲醚含量测定的检测波长。

本方法测定首乌益智胶囊中大黄素和大黄素甲醚的含量，结果可靠，且处理方法简便，流动相组成简单，可用于控制其质量。

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HPLC based content determination of emodin and emodin monomenthyl ether from Shouwuyizhi capsule

DING Xiao-yan, LIU Qing, JIA Yuan-yin, ZHAO Bo-nian

(Shandong Provincial Key Laboratory of Chinese Medicine Quality Standard Research, Shandong Academy of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250014, China)

∶We constructed a HPLC based content determination method for emodin and emodin monomenthyl ether from Shouwuyizhi capsule. Samples were separated by C18(250 nm×4.6 nm, 5 μm) column with methanol-0.1% phosphoric acid water (82:18,V/V) as mobile phase. Determination conditions were determination wavelength of 289 nm, flow rate of 1.0 mL/min, and column temperature of 30 ℃. Better linear relationship exists in the range 0.019～0.19 μg(R=0.999 9,n=5) for emodin, and in the range 0.021～0.21 μg(R=1.000 0，n=5)for emodin monomenthyl ether. Their average recovery rates are respectively 98.58% and 100.01%, and RSDs are 2.66% and 1.15%. Results show that the method has strong specificity and accuracy, so it can be applied to simultaneous content determination of emodin and emodin monomenthyl ether from Shouwuyizhi capsule.

∶Shouwuyizhi capsule; emodin; emodin monomenthyl ether; HPLC; content determination

10.3976/j.issn.1002-4026.2016.05.006

2016-04-01

山东省自主创新及成果转化专项(20140ZZCX2303)

丁晓彦(1983—)，女，助理研究员，研究方向为中药质量控制。Email:kate-66@163.com

*通信作者，赵渤年，男，研究员，博士生导师。Email:bonianzh@163.com

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