实时荧光核酸恒温扩增技术在解脲脲原体检测中的应用

陈小波，朱庆文，徐爱萍，苏良香，费倩倩

(江苏省南通市妇幼保健院：1.产前诊断中心；2.生殖助孕中心 226001)



·临床研究·

实时荧光核酸恒温扩增技术在解脲脲原体检测中的应用

陈小波1，朱庆文1，徐爱萍1，苏良香1，费倩倩2△

(江苏省南通市妇幼保健院：1.产前诊断中心；2.生殖助孕中心 226001)

目的 应用实时荧光核酸恒温扩增检测技术(SAT)对不孕不育症患者的泌尿生殖道拭子及尿液进行解脲脲原体(UU)检测，并评价其敏感性和特异度。方法 对452例不孕不育症患者的泌尿生殖道拭子标本，采用SAT检测法、培养法、荧光定量聚合酶链反应(PCR)进行UU检测，同时再对同一患者的尿液标本进行SAT检测，根据实验结果评估SAT在拭子及尿液标本UU检测中的灵敏度和特异度；同时UU培养阳性的标本经过临床UU规范治疗后，仍采用上述方法对患者进行UU复查，根据实验结果评估SAT在UU检测中的判断预后效果。结果 初检时与UU培养结果作比较，UU-SAT拭子标本的检测灵敏度为97.1%(170/175)，特异度为97.8%(271/277)，差异无统计学意义(χ2=0.010 2，P=0.919 7)；UU-SAT尿液标本的检测灵敏度为96.0%(168/175)，特异度为98.9%(274/277)，差异无统计学意义(χ2=0.163 5，P=0.686 0)。结论 SAT检测泌尿生殖道患者拭子及尿液UU检测具有很高的灵敏度和特异性，同时又有很好的判愈效果，为UU的临床实验室诊断提供了新的检测手段。

实时荧光核酸恒温扩增检测技术； 解脲脲原体； 尿液检测； 聚合酶链反应

解脲脲原体(UU)是一类原核细胞型微生物，是泌尿生殖道感染的常见病原体之一，它不仅引起非淋菌性尿道炎，还可引起多种泌尿生殖道疾病，如前列腺炎、附睾炎、宫颈炎、输卵管炎及其导致的输卵管妊娠等，是导致不孕不育症的重要原因之一。近年来，随着不孕不育症发病率的逐渐上升，UU引起的生殖道感染日益受到关注。本文采用实时荧光核酸恒温扩增检测技术(SAT)对患者的泌尿生殖道拭子及尿液标本进行UU的RNA检测。SAT技术是建立在RNA恒温扩增技术和实时荧光检测技术基础上的第二代核酸检测技术。现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 标本来源 所有452例患者标本均为2015年9月至2016年2月来本院生殖助孕中心就诊并计划行体外受精联合胚胎移植(IVF)手术的患者，其中男125例，女327例，年龄23～45岁，男性取尿道拭子及尿样,女性取宫颈拭子及尿样。

1.2 标本采集 拭子标本采集：用医用棉拭子伸入男性尿道口或女性宫颈口约1～2 cm，旋转1周，停留10 s后取出，并将拭子头放入1 mL生理盐水浸泡贴管壁挤干，取0.5 mL加入0.5 mL专用尿液保存液混匀，立即检测或-20 ℃保存待测。尿液标本采集：取清晨首次尿，或长时间(至少1 h)不排尿后的首段尿1 mL加入1 mL专用尿液保存液混匀，立即检测或-20 ℃保存待测。

1.3 试剂与仪器 UU核酸检测试剂盒(RNA恒温扩增)和专用磁珠分离装置(上海仁度生物科技有限公司)；UU核酸扩增聚合酶链反应(PCR)荧光定量检测试剂盒(中山大学达安基因股份有限公司)；UU培养鉴定药敏试剂盒(珠海丽珠试剂有限公司)；ABI Prism 7500实时荧光定量PCR仪。

1.4 方法 同一患者拭子用培养法检测，尿液用SAT进行检测，若同一患者培养和SAT检测结果不一致，用PCR法对留存的拭子标本进行复测，操作严格按照说明书进行。

1.5 标本检测 同一患者收集到的3份拭子标本分别做UU培养、UU-PCR及UU-SAT，尿液标本只做UU-SAT。若培养检测阳性，根据临床规范化治疗后，再次采集治疗后患者的生殖道拭子及尿液标本，采用初检时检测的方法和步骤进行复检。

1.6 统计学处理 采用SPSS13．0统计软件进行处理。计数资料以率表示，比较采用χ2检验，以P<0．05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 452例初检结果 与UU培养结果作比较，UU-SAT拭子标本的检测灵敏度为97.1%(170/175)，特异度为97.8%(271/277)，差异无统计学意义(χ2=0.010 2，P=0.919 7)；UU-SAT尿液标本的检测灵敏度为96.0%(168/175)，特异度为98.9%(274/277)，差异无统计学意义(χ2=0.163 5，P=0.686 0)，见表1。

2.2 疗效判愈实验室指标分析 对175例UU-培养阳性患者进行临床规范治疗后再次采集标本，按原方法进行复检，与UU培养结果作比较，UU-SAT拭子标本的检测灵敏度为97.8%(44/45)，特异度为99.2%(129/130)；UU-SAT尿液标本的检测灵敏度为93.3%(42/45)，特异度为98.5%(128/130)，见表2。

表1 452例患者初检3种方法的检测结果(n)

表2 175例“培养初检阳性”患者规范治疗后的复检结果(n)

3 讨 论

UU是一类大小介于细菌和病毒之间的没有细胞壁的原核细胞微生物，是人类泌尿生殖道的常见病原体之一，也是育龄夫妇不孕不育的重要原因之一[1-3]。目前，UU临床检测主要有培养法和荧光定量PCR法，两种检测方法的标本来源均取自患者的泌尿生殖道分泌物，侵入式取样，容易增加患者的抵触情绪。同时培养法检测对标本的采集和保存要求都很高，存在培养时间长、主观判读，灵敏度和特异度都有所不足。SAT是采用RNA恒温扩增技术原理，结合实时荧光检测的一种新的RNA检测技术。本文使用SAT技术对患者拭子及尿液标本进行UU RNA检测，结果显示SAT法具有很高的灵敏度和特异度，同时又有很好的判愈效果。实验表明该检测可以使用尿液作为标本进行检测，实现无创取样，改变目前UU检测大多用泌尿生殖道拭子标本的现状，优化了取样流程。

在初检结果中，与UU培养结果作比较，UU-SAT拭子标本的检测灵敏度为97.1%(170/175)，特异度为97.8%(271/277)，差异无统计学意义(χ2=0.010 2，P=0.919 7)；UU-SAT尿液标本的检测灵敏度为96.0%(168/175)，特异度为98.9%(274/277)，差异无统计学意义(χ2=0.163 5，P=0.686 0)。对于SAT检测阳性而PCR法或培养法检出阴性的情况，作者认为原因可能是：采集的试纸中病原菌含太少，培养灵敏性不足，也可能是患者正处于感染初期，病原体DNA量较少，RNA量相对较多，则以检测RNA的SAT能检测到病原体的存在。SAT法核酸提取过程中，反应抑制物少，可有效减少假阴性，提高检测灵敏度[4-5]；对于SAT检测阴性而PCR法或培养法检出阳性的情况，可能是标本保存不当引起检测的RNA丢失；尿液中存在着抑制核酸扩增的物质或者UU特异度序列突变；也很可能是操作过程中受到RNase的作用使得RNA降解，因此实验过程中必须使用专用加样器，离心管、洗头等一次性耗材实验前必须全部高压灭菌。但正是RNA容易降解的特点，使得SAT实验后扩增的RNA能迅速降解，大大降低了PCR实验室内交叉污染引起的假阳性问题[6]。近年来研究认为，PCR法虽然有较高的灵敏度和特异度，但不能区分所检测的DNA是来自活菌还是死菌，患者治疗后病菌死亡，但病菌DNA仍在体内继续存在一段时间，PCR检测阳性，容易导致过度治疗[7-11]。本文复查175例UU培养阴性患者中仍有8例PCR检测显示阳性，作者认为可能和上述原因有关，因而PCR法在判断愈后方面有所不足。此外，对175例UU-培养阳性患者进行临床规范治疗后再次采集标本，按原方法进行复检，与UU培养结果作比较，UU-SAT拭子标本的检测灵敏度为97.8%(44/45)，特异度为99.2%(129/130)；UU-SAT尿液标本的检测灵敏度为93.3%(42/45)，特异度为98.5%(128/130)；在复查时发现，虽然经过了规范的治疗但仍有45例患者标本检测结果阳性，作者认为这可能和患者对药物治疗的个体差异、耐药性或针对特殊人群的治疗方案有关，具体原因有待探讨。

需要强调的是，现在认为UU也是正常人泌尿生殖道中寄居的微生物之一，UU检测阳性并不完全表示泌尿生殖感染，只提示泌尿生殖道UU的存在，诊断还需与患者的临床症状相结合。

综上所述，实时荧光核酸恒温扩增检测技术作为新一代的核酸检测技术在临床实验室生殖道UU检测中，既具备了PCR的高灵敏度和高特异度，又具有很好的判断预后效果，同时又可采用尿液作为检测标本，方便患者及医务人员，适合临床实验室泌尿生殖道患者UU的检测，是值得推广的一种检测方法。

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10.3969/j.issn.1673-4130.2016.23.045

A

1673-4130(2016)23-3348-03

2016-06-15

2016-09-05)

△通讯作者，E-mail:95235205@qq.com。