脂肪酶的固定化及其在食品领域的应用

魏雪 孙丽超 李淑英 王凤忠 辛凤姣

（中国农业科学院农产品加工研究所，北京 100193）

脂肪酶的固定化及其在食品领域的应用

魏雪 孙丽超 李淑英 王凤忠 辛凤姣

（中国农业科学院农产品加工研究所，北京 100193）

脂肪酶（lipase，EC 3.1.1.3）是一类能将长链脂肪酸甘油酯水解成脂肪酸和单甘油酯、甘油二酯或甘油的生物酶，主要来源于动物、植物和微生物。脂肪酶在食品领域的应用有巨大潜能，改善脂肪酶的性能对于实现工业上连续化和低成本的生产具有重要的意义。固定化酶技术可以通过提高脂肪酶的酶活力、稳定性及回收率显著改善脂肪酶的性能。固定化脂肪酶在食品领域中被广泛应用于糖酯合成、油脂改性、芳香味酯类化合物及抗坏血酸酯类抗氧化剂的合成。介绍了脂肪酶及固定化酶技术，并综述了近7年固定化脂肪酶在食品领域中的应用。最后对如何提高脂肪酶性能进行了展望。

脂肪酶；固定化脂肪酶；食品领域应用

脂肪酶（lipase，EC 3.1.1.3），全称为三酰基甘油水解酶，是一类能够将长链脂肪酸甘油酯水解成脂肪酸和单甘油酯、甘油二酯或甘油的生物酶，可来源于动物、植物及微生物［1］。其能催化水解、酯化、酯交换等反应类型，反应具有条件温和、耗能低、原料要求低、成品质量高等优点，可应用于食品、医药及生物柴油等领域，有巨大的应用潜力［2］。

虽然脂肪酶在工业上有着广泛的应用，但大多寿命短，且游离酶在有机相中不溶解，反应过程中容易结块，大大降低了酶的可利用率，酶回收率低，产品分离困难，而且很昂贵［3］。利用固定化技术将酶固定在惰性载体上，可以改善酶在有机相中的溶解性能，提高利用率、回收率等，有利于连续化和低成本生产，因此脂肪酶催化技术的工业化很大程度上取决于酶的固定化［4］。本文总结了近7年脂肪酶在食品领域的应用，以期为研究固定化脂肪酶应用于食品工业奠定基础。

1 脂肪酶及固定化脂肪酶在食品领域的应用

1.1 脂肪酶

脂肪酶广泛存在于动物、植物及微生物中［1］。从1834年发现兔胰脂肪酶活性距今已有上百年的研究历史。

动物中脂肪酶家族主要包括脂蛋白脂肪酶（LPL）、肝脂肪酶（LIPC）、胰脂肪酶（PL）、内皮脂肪酶（EL）、丝氨酸磷脂酶（PLA1A）、H 型脂肪酶（LH）、胰脂肪酶相关蛋白 1（PLRP1）和胰脂肪酶相关蛋白 2（PLRP2）八种成员，除 PLRP1无活性之外，其他成员均可水解甘油三酯及磷脂等脂类物质［5-7］。

根据不同植物的基因组测序结果，目前已鉴定出1 100个GDSL脂肪酶基因，分别为拟南芥（Arabidopsis thaliana）的GDSL家族脂肪酶108个成员［8，9］，水稻（Oryza sativa）114个成员，玉米（Zea mays）53个成员，江南卷柏（Selaginella moellendorffii）90个成员，蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）88个成员，葡萄（Vitis vinifera）96个成员、高粱（Sorghum bicolour）130个成员、杨树（Populus trichocarpa）126个成员、小立碗藓（Physcomitrella patens）57个成员和几种藻类植物的200多个成员［9］。

产脂肪酶的微生物种类很多，迄今已报道的有65个属，细菌28个属，酵母菌10个属，放线菌4个属，其它真菌23个属［10］。

1.2 脂肪酶的结构及酶学性质

不同物种来源的脂肪酶同源性相对较低，氨基酸组成和分子量大小存在较大差异，如Rhizopus oryzae脂肪酶大小为 16.25 kD［11］，而来源于人体的hormone-sensitive脂肪酶分子量高达 116.6 kD［12，13］。不同来源的脂肪酶在一级结构氨基酸序列上差异极大，但二级结构相对比较保守，为典型的α/β水解酶折叠（α/β hydrolase fold）结构，如图1-A所示。其中，β折叠数量及其扭曲角度和α螺旋的数量和位置不同［14，15］。脂肪酶的催化三联体中心为丝氨酸-天冬氨酸-组氨酸，该催化中心在氨基酸序列和空间排布上也极为保守［14］。图1-B所示为脂肪酶TLL（Thermomyces lanuginose lipase）的突变体TLL（S146A）的三维结构（PDB编码：1GT6），其催化三联体的146位丝氨酸已被突变成丙氨酸，以便于结晶［16］。

图1 脂肪酶的结构

脂肪酶的天然底物通常是长链甘油三酯等不易溶于水的化合物，当催化水溶性底物或天然底物的浓度低于其溶解度时，脂肪酶表现出极低催化活力，当底物浓度超过其溶解度时，会出现“油水”界面（Water-oil interface），脂肪酶的催化活力会急剧提高，直到最大催化活力，这种独特的催化特性被称为“界面激活”（Interfacial activation）现象。脂肪酶在“油水”两相体系中催化的水解反应不符合“米氏”动力学的一般规律［17］。

蛋白质晶体学研究表明，脂肪酶在溶液中存在两种天然构象：一种是闭合构象（Closed conformation），此时脂肪酶的催化活性中心被一段“盖子”结构覆盖，底物无法进入催化口袋，催化反应无法进行；另外一种构象是“盖子”处于打开状态的构象（Open conformation），“盖子”区域侧向移动，将催化中心暴露出来，底物可以自由进入催化口袋，催化反应得以顺利发生［18］。

不同来源脂肪酶的最适pH值不同，大多为中性或碱性脂肪酶；最适温度相差迥异，就微生物来源脂肪酶来讲，真菌来源脂肪酶的最适温度相对较低，而细菌脂肪酶则相对较高。就温度稳定性而言，脂肪酶在水相中对温度较敏感，而在有机相中，其稳定性大大提高［19］。脂肪酶对不同底物脂肪酸长度和饱和度、底物甘油三酯不同位置酯键的识别和水解、底物立体对映结构1，3位酯键的识别和水解均具有选择性，脂肪酶的底物专一性取决于酶的分子结构尤其是催化中心结构［20］。

1.3 固定化脂肪酶在食品领域的应用

1.3.1 固定化酶技术 固定化酶技术是利用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内，但仍具有催化活性，并可回收及重复使用的一类技术。利用固定化技术将脂肪酶固定在惰性载体上，可以提高其在有机相中的扩散效果和热稳定性，同时有利于酶的回收、连续化和低成本生产。到目前为止，用于固定化酶的方法主要有包埋法、吸附法、共价结合法及交联法；载体方面，已经有不同形态、不同功能的载体被用于固定化酶，包括天然高分子材料、无机材料、合成高分子材料以及具有特定功能的新型载体材料等［21］。

固定化酶技术可以较好地提高脂肪酶的活性。Ghattas等［22］将Rhizopus oryzae脂肪酶完全吸附到辛基-琼脂糖和C-18柱上，结果表明，固定化后的脂肪酶为超激活状态，其活性大约为游离酶的2.5倍。Yan等［23］将Yarrowia lipolytica脂肪酶2固定在大孔树脂，比活性为809.751 U/g，为游离酶的2.1倍。

固定化酶技术可以显著提高脂肪酶的操作稳定性。Aybastıer等［24］将Thermomyces lanuginosus脂肪酶共价结合在一种新型微孔苯乙烯-二乙烯苯聚戊二醛共聚物上，结果表明，通过该技术制备出的固定化脂肪酶具有很强的操作稳定性，24 h内被连续重复使用10个批次后，仅有12%的酶失活。Khoobi等［25］通过物理吸附及共价连接，将Thermomyces lanuginosa脂肪酶固定在磁性纳米颗粒，结果表明，与游离酶进行对比，在聚乙烯亚胺磁性纳米颗粒MNPs@PEI-GLU上的脂肪酶使用12个循环后仍保留最初活性的80%。

固定化酶技术提高了脂肪酶的热稳定性。Li等［26］将Candida sp. 99-125脂肪酶通过物理吸附固定在硅烷化介孔材料SBA-15，并将其在50℃孵育观测热稳定性，结果表明，与游离酶相比，固定后的脂肪酶的活性损失率低，热稳定性较高。Jun等［27］通过双固定，即大孔聚丙烯酸酯物理吸附和硅基修饰多肽silaffin R1介导的生物硅化固定Candida antarctica脂肪酶B，结果表明，双固定后脂肪酶的T-50（60）从45℃提高到72℃，且多次循环后无活性损失。

1.3.2 固定化脂肪酶在食品领域的应用

1.3.2.1 合成糖酯 糖酯是一类以糖基为亲水基团，脂肪酸为疏水基团，同时具有亲水性和亲油性的非离子型生物表面活性剂。糖酯类食品添加剂具有优良表面活性、生物可降解性、无臭、无刺激等优点，某些糖酯还具有抑菌、抗病毒等活性，现已作为食品乳化剂、质地改良剂、保鲜杀菌剂、抗老化剂等广泛应用于食品工业。

Adnani等［28］将固定化脂肪酶Novozym 435（将Candida antarctica脂肪酶固定在大孔树脂），以木糖醇和硬脂酸为底物，己烷为反应介质，合成木糖醇脂肪酸酯，结果表明，实际产率高达96.10%。Zaidan等［29］通过共价键结合及物理吸附的方法，将Candida rugosa脂肪酶（CRL）分别固定在氨基活化云母（Amino-CRL）及纳米反应器（NER-CRL）上，催化合成乳糖酯类，结果表明，与游离的CRL相比，Amino-CRL及NER-CRL比活分别提高了2.4倍和2.6倍，并且都表现出显著的操作稳定性。

1.3.2.2 油脂改性 油脂改性是食品加工过程中的一个重要环节。改变油脂的物理化学性质，开发较高营养价值的油脂具有重大的价值和市场潜力。脂肪酶具有位置特异性和脂肪酸特异性，可以作为油脂改性的生物催化剂，通过催化酯交换、酯转移、水解等反应，可以使便宜的、营养价值低的油脂升级为昂贵的、营养价值高的油脂，所以在油脂工业中有广泛应用。

Esenduran等［30］将商业非选择性Candida Antarctica脂肪酶（Novozym 435）和Rhizopus oryzae脂肪酶固定在有机-无机杂化有机硅聚乙烯醇基质上，通过酶法酯交换，调整乳脂的物理性质，获得了具有适合用于食品工业生产的脂肪混合物。Tecelão等［31］利用商业性固定化脂肪酶Lipozyme RM IM，Lipozyme TL IM和Novozym 435，合成ω-3多不饱和脂肪酸，结果表明，在Novozym 435、Lipozyme RM IM、游离酶及Lipozyme TL IM催化下，生成的ω-3多不饱和脂肪酸的摩尔比例分别为21.6%、20%、8.5%及8.2%。

1.3.2.3 合成芳香味酯类化合物 芳香化合物酯类化合物由短链脂肪酸和醇类化合物组成，是风味和香味的主要组分，在制药、化妆品和食品等工业领域具有广泛的应用，如丁酸丁酯、乙酸异戊酯、乙酸香叶酯和丁酸香叶酯等芳香味脂类化合物常用在食品工业中调节食品风味。虽然芳香化合物可以通过传统的方法如化学合成或从自然资源中提取得到，但是利用这些方法可能带有许多副产物或毒性物质。通过脂肪酶催化酯化合成可以有效避免这些弊端。

Matte等［32］将Thermomyces lanuginosus脂肪酶（TLL）多点共价固定在天然Immobead 150上，合成丁酸丁酯和丁酸异戊酯，结果表明，TLL被固定后，70℃下的半衰期为5.32 h，比游离态的稳定性约高3倍，固定化酶在丙酮、己烷和异辛烷中表现出较高的稳定性，酯化24 h后，收率在60%以上。Damnjanović等［33］将Candida rugosa 脂肪酶共价固定在sepabeads®ec-ep上催化丁酸和香叶醇的酯化生成丁酸香叶酯。Gupta等［34］也曾将TLL固定在不同的聚丙烯腈纳米纤维膜上，合成乙酸香叶酯，通过物理吸附和共价固定后酶的酯交换能力分别提高了32倍及9倍。

1.3.2.4 合成抗坏血酸酯类抗氧化剂 异抗坏血酸可作为抗氧化剂广泛用于食品工业。然而，由于其高度亲水的性质，限制其在油脂类食品中的应用。将异抗坏血酸转化为异抗坏血酸酯类物质可以有效提高其亲脂性，能更好地应用于基于脂质的食品中。利用固定化脂肪酶催化反应，可在一定程度上提高异抗坏血酸酯类物质的产率。

Sun等［35］利用固定化脂肪酶Novozym 435，将D-异抗坏血酸与棕榈酸转化为异抗坏血酸棕榈酸酯，产率高达95.32%；Santibáñez等［36］利用Pseudomonas stutzeri脂肪酶和固定化脂肪酶Novozym 435，合成异抗坏血酸棕榈酸酯，最优反应条件下，固定化Pseudomonas stutzeri脂肪酶与Novozym435催化可分别获得57%及51%的底物转化率。

Reyes-Duarte等［37］利用两种固定化脂肪酶Lipozyme TL IM和Novozym 435合成6-O-抗坏血酸油酸酯和6-O-抗坏血酸棕榈酸酯，其产率分别为前者（64%和27%）、后者（84%和33%），且合成的6-O-抗坏血酸油酸酯和6-O-抗坏血酸棕榈酸酯均表现出优异的抗氧化能力。

1.3.2.5 其他 固定化脂肪酶在食品领域除用于糖酯合成、油脂改性、芳香味酯类化合物及抗坏血酸酯类抗氧化剂的合成外，还可用于处理餐饮废油、果渣及生成一些重要产物。Lopresto等［38］将Pseudomonas cepacia脂肪酶共价结合到环氧丙烯酸树脂上，催化煎炸废油等废弃植物油合成生物柴油。Yücel等［39］将Thermomyces lanuginosus脂肪酶用共价法固定在橄榄果渣上，制备生物柴油，最优反应条件下，最高转化率为93%，且固定化脂肪酶重复利用10次后仍保留80%以上的活性，操作稳定性显著。Zhong等［40］利用固定化Candida rugosa脂肪酶合成蔗糖-6-乙酸酯，结果表明，最优反应条件下，蔗糖-6-乙酸酯产率高达78.68%，经过6次循环后仍保持高催化活性，热稳定性和操作稳定性显著改善。

2 展望

根据我国食品工业十三五规划，目前食品调味品的行业景气度呈现最佳。虽然脂肪酶已在食品添加剂的合成及油脂改性等食品领域发挥了重要作用，但仍具有很大的开发潜能，如应用于更多品种的食品添加剂合成。因此，利用固定化酶技术提高脂肪酶的酶活力、稳定性及回收率等性能，使脂肪酶更好地应用于食品领域，仍具有广阔的研究空间。

固定化酶技术虽然可以在一定程度上改善脂肪酶的特性，但是却无法从本质上改造脂肪酶。分子水平上，根据对酶结构功能关系的了解程度，进行理性或非理性设计，是提高脂肪酶特性的重要方法。理性设计是指对酶结构与功能关系了解较透彻情况下鉴定出酶分子的关键活性位点，并通过取代、插入或删除等手段对需要突变的活性位点进行精确设计，从而改变酶学性质。非理性设计包括定向进化技术（directed evolution）和化学修饰法。其中，定向进化技术不需要对酶结构与功能关系深刻了解，只需通过随机突变和片段重组模拟自然进化，构建一定容量的突变库，通过高通量筛选，最后得到预期性质的突变体，但这种方法缺乏目的性。化学修饰则需要根据酶的特性以及需求来选择合适的化学试剂及修饰方法，但通常伴随酶活性的损失和酶稳定性的下降，且不同批次化学修饰的酶分子之间存在差异性，因此，这种方法在酶改造中的应用也较为受限。而将理性设计和非理性设计相结合的半理性设计，是在对酶的结构有一定了解后，选取多个靶标位点，构建较小的突变库，简单筛选后进而得到优异的突变体。因此，理性设计和半理性设计是未来分子水平上对脂肪酶改造的主要方向。实际工业生产过程中，还要考虑如何提高脂肪酶的异源表达量。切除N末端冗余肽段、密码子优化、分子伴侣共表达等方法的研究是提高脂肪酶异源表达水平的重要方式。综上所述，通过这些设计思路改善脂肪酶性能进而扩展其在食品领域的应用，将具有很大的研究前景。

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（责任编辑 马鑫）

Immobilization of Lipase and Its Application in Food Industry

WEI Xue SUN Li-chao LI Shu-ying WANG Feng-zhong XIN Feng-jiao
（Institute of Food Science and Technology in CAAS，Beijing 100193）

Lipase（EC 3.1.1.3）is a kind of enzyme that can hydrolyze long chain fatty acid esters into fatty acid and monoglyceride，diglyceride or glycerol，and it is mainly from animals，plants and microorganisms. Considering the great application potential of lipase in the food industry，optimization of lipase performance is of significance for achieving continuous and low-cost production. Immobilized enzyme technology significantly enhanced the lipase performance by increasing the enzymatic activity，stability and the recovery rate. Therefore，immobilized lipase is widely used in the food industry，including the enzymatic synthesis of glycolipids，oil modification，and the synthesis of aromatic ester compounds and ascorbyl esters. This article introduces the lipase and the immobilized enzyme technology，and mainly reviews the application of immobilized lipase in the food industry in last seven years，finally prospects how to improve the performance of lipase.

lipase；immobilized lipase；application in food industry

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.11.008

2016-04-19

国家自然科学基金面上项目（31571963）

魏雪，女，硕士，研究方向：微生物分子生物学与基因工程；E-mail：15701202366@163.com

王凤忠，男，研究员，研究方向：功能食品与生物活性物质；E-mail：wangfengzhong@sina.com辛凤姣，女，研究员，研究方向：微生物分子生物学与基因工程；E-mail：xinfengjiao@caas.cn