新疆阿魏乙酸乙酯部位质量控制方法研究

张海英，李伟，周龙龙，姜林，周铭心

1.新疆医科大学附属中医医院，新疆 乌鲁木齐 830000；2.新疆医科大学，新疆 乌鲁木齐 830011

新疆阿魏乙酸乙酯部位质量控制方法研究

张海英1，李伟1，周龙龙2，姜林1，周铭心2

1.新疆医科大学附属中医医院，新疆 乌鲁木齐 830000；2.新疆医科大学，新疆 乌鲁木齐 830011

目的 建立新疆阿魏乙酸乙酯部位质量控制方法。方法 采用高效液相色谱法测定新疆阿魏乙酸乙酯部位的阿魏酸、法尼斯淝醇A、法尼斯淝醇C含量。色谱柱为Waters XTerra RPC18（250 mm×4.6 mm，5 µm），以乙腈-0.1%磷酸水为流动相，梯度洗脱，流速1.0 mL/min，检测波长324 nm，柱温30 ℃，进样量10 µL。结果 阿魏酸、法尼斯淝醇A、法尼斯淝醇C分别在0.05～1.0、0.132～2.64、0.118～2.36 mg/mL范围内线性关系良好，平均回收率分别为99.34%、98.96%、99.24%。新疆阿魏乙酸乙酯部位的阿魏酸、法尼斯淝醇A、法尼斯淝醇C含量分别为33.4、76.5、72.3 mg/g。结论 该方法操作简单，结果准确，具有较好的重复性和稳定性，可为新疆阿魏乙酸乙酯部位的质量控制提供参考。

新疆阿魏；乙酸乙酯部位；阿魏酸；法尼斯淝醇A；法尼斯淝醇C；质量控制

阿魏属隶属于伞形科前胡族，约有150余种，主要分布于地中海、中亚及其邻边地区，我国约有26种1变种[1]，主要分布于新疆。2010年版《中华人民共和国药典》收载的阿魏为伞形科植物新疆阿魏Ferula sinkiangensis K.M.She或阜康阿魏Ferula fukanensis K.M.Shen的树脂，味苦、辛，温，归脾、胃经，具有消食、化癥、散痞、杀虫功效[2]。近年来，由于发现其具有植物雌激素作用和抗癌活性而倍受关注。新疆少数民族用其治疗胃肠道肿瘤。国外研究表明阿魏同属植物有明确的抗肿瘤作用[3-4]。本课题前期研究结果表明，新疆阿魏乙酸乙酯部位对人结肠癌HCT116细胞有一定的抑制增殖和促进凋亡作用，表明新疆阿魏有抗肿瘤作用[5]。

本研究检测的除阿魏酸外的特征成分法尼斯淝醇A、法尼斯淝醇C在阿魏属的多个种如Ferula assafoetida、Ferula persica等均分离得到，且发现在抗癌方面具有很好的药理活性。法尼斯淝醇A在剂量1 mg/kg能够极大抑制小鼠肺癌细胞株移植的肺癌模型小鼠的癌细胞扩散面积，还能通过影响血管内皮生长因子受体（VEGFR）1和VEGFR2来抑制肿瘤的新生血管生成；能够抑制巨噬细胞内一氧化氮合成和刺激脂多糖与干扰素-γ，从而治疗一些神经性病变[6]。法尼斯淝醇C则对多耐耐药肿瘤细胞有非常好的效果，能抑制耐药肿瘤细胞胞内糖蛋白（p-gp）的运输功能，阻止p-gp将胞内的抗肿瘤药物排出胞外，在低浓度0.5 µg/mL就能有效抑制多药耐药肿瘤细胞株MCF7/ADR的p-gp的运输功能[7]。可见，阿魏酸、法尼斯淝醇A、法尼斯淝醇C可视为新疆阿魏发挥抗肿瘤作用的物质基础。基于中药多成分多靶点作用特点，本研究同时测定新疆阿魏乙酸乙酯部位中阿魏酸、法尼斯淝醇A、法尼斯淝醇C含量，为进一步完善新疆阿魏乙酸乙酯部位的质量控制提供一定的参考依据。

1 仪器与试药

AL 204电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；超声波清洗机（200 W，40 kHz），昆山市超声仪器有限公司；Direct-QTM5超纯水仪，Millipore；微孔滤膜，上海半岛实业有限公司净化器材厂；无油真空泵，HP-01；高效液相色谱仪，Waters 2695，DAD检测器。

阿魏药材为伞形科植物新疆阿魏Ferula sinkiangensis K.M.Shen的树脂，购于新疆伊犁，经新疆伊犁州食品药品检验所检验合格，批号20120004。

阿魏酸对照品，中国食品药品检定研究院，批号110773-201012；法尼斯淝醇A、法尼斯淝醇C对照品，沈阳药科大学制备，经UV、NMR、MS、IR鉴定，HPLC纯度不低于98%。色谱乙腈（美国Fisher Scientific），水为超纯水，磷酸、乙酸乙酯、石油醚等均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Waters XTerra RPC18（250 mm×4.6 mm，5 µm）；以乙腈为流动相A，0.1%磷酸水为流动相B，进行梯度洗脱（0～25 min，15%～30%A；25～35 min，30%A；35～55 min，45%A；55～85 min，50%A～60A%）；流速：1.0 mL/min；检测波长：324 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 µL[8-9]。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 分别精密称取阿魏酸、法尼斯淝醇A、法尼斯淝醇C 5.02、13.22、11.84 mg于10 mL容量瓶，加甲醇超声溶解后，定容，即得。2.2.2 供试品溶液的制备 取新疆阿魏400 g，用2000 mL石油醚（30～60 ℃）超声提取40 min，控温在40 ℃以下，提取2次，过滤，弃去石油醚，残渣挥尽石油醚后，用乙酸乙酯2000 mL超声提取2次，每次30 min，过滤，合并提取液，减压浓缩，即得阿魏乙酸乙酯部位60.81 g。取阿魏乙酸乙酯部位0.20 g，精密称定，置于50 mL容量瓶中，加适量甲醇，超声提取20 min，再用甲醇定容，过0.45 μm微孔滤膜，作为供试品溶液。

2.3 系统适用性试验

按上述色谱条件，分别精密吸取阿魏酸、法尼斯淝醇A、法尼斯淝醇C对照品溶液及供试品溶液各10 μL，分别进样。在100～400 nm范围内，3种对照品及供试品的紫外-可见光谱均在324 nm处有最大吸收，由此确定检测波长为324 nm。在所选择的色谱条件下，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，有相同保留时间的色谱峰，且与其他成分分离度良好。色谱图见图1。

2.4 线性关系考察

阿魏酸对照品以甲醇为溶剂配制0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.0 mg/mL的系列溶液，在上述色谱条件下分别进样分析，在0.05～1.0 mg/mL范围内，得线性方程Y＝4 084 578X＋10 468，r＝0.999 6。

法尼斯淝醇A对照品以甲醇为溶剂配制0.132、0.264、0.528、1.056、2.112、2.64 mg/mL的系列溶液，在上述色谱条件下分别进样分析，在0.132～2.64 mg/mL范围内，得线性方程Y＝19 876 178X＋490 60，r＝0.999 4。

法尼斯淝醇C对照品以甲醇为溶剂配制0.118、0.236、0.472、0.944、1.888、2.36 mg/mL的系列溶液，在上述色谱条件下分别进样分析，在0.118～2.36 mg/mL范围内，得线性方程Y＝21 292 276X－570 646，r＝0.999 5。

图1 阿魏乙酸乙酯部位中阿魏酸、法尼斯淝醇A、法尼斯淝醇C HPLC图

2.5 精密度试验

分别取法尼斯淝醇A、法尼斯淝醇C、阿魏酸对照品溶液，连续进样5次，记录色谱峰，计算3种对照品峰面积的RSD分别为1.24%、0.98%、1.12%，结果表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

取同一供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24、48 h检测，记录色谱峰，计算法尼斯淝醇A、法尼斯淝醇C、阿魏酸峰面积的RSD分别为1.56%、1.47%、1.23%，结果表明供试品溶液在48 h内稳定。

2.7 重复性试验

取同一批次阿魏乙酸乙酯部位提取物，按“2.2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，进行检测，记录色谱图和峰面积，计算法尼斯淝醇A、法尼斯淝醇C、阿魏酸峰面积的RSD分别为1.79%、1.17%、1.58%，结果表明本方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验

取阿魏乙酸乙酯部位约0.1 g，精密称定，置于50 mL锥形瓶中，制作6份，加入阿魏酸4.137 5 mg、法尼斯淝醇A 7.153 4 mg、法尼斯淝醇C 6.953 4 mg，加适量甲醇，超声提取20 min，用甲醇定容，过0.45 μm微孔滤膜，按上述色谱条件进行检测。测得阿魏酸、法尼斯淝醇A、法尼斯淝醇C平均回收率分别为99.34%、98.96%、99.24%，RSD分别为1.83%、2.12%、1.35%，符合回收率要求，见表1。

表1 阿魏酸、法尼斯淝醇A、法尼斯淝醇C加样回收率试验

2.9 样品含量测定

精密称取阿魏乙酸乙酯部位0.2 g，共3份，按供试品溶液制备方法制备，按上述色谱条件测定样品含量，并取平均值。结果新疆阿魏乙酸乙酯部位中阿魏酸、法尼斯淝醇A、法尼斯淝醇C含量分别为（33.4±0.3）、（76.5±1.4）、（72.3±0.6）mg/g。

3 讨论

3.1 色谱峰光谱一致性检测

应用二级管阵列检测器和色谱工作站，对样品中法尼斯淝醇A、法尼斯淝醇C、阿魏酸和对照品进行紫外-可见吸收光谱扫描，结果两者紫外-可见吸收图谱基本一致。

3.2 色谱条件的考察

本试验比较了甲醇-水系统和乙腈-水系统，在使用甲醇-水系统时，杂质较多，难以达到满意的分离效果，故选择紫外吸收较小的乙腈-水系统。流动相中性的条件下，色谱峰分离度不好，严重拖尾，对0.05%、0.1%、0.15%不同浓度的磷酸溶液进行了考察，结果使用0.1%磷酸能很好地抑制峰拖尾，且相对稳定，所以流动相最终确定为乙腈-0.1%磷酸溶液[10]。

3.3 提取方法的选择

本试验对阿魏乙酸乙酯部位采用了回流提取与超声提取，发现二者特征成分含量差异不大，但超声提取简单、易行，故采用超声提取法。在对超声提取溶剂进行筛选时，比较了甲醇-甲酸（95∶5）、乙醇及甲醇的差异，结果发现，甲醇提取的供试品溶液特征成分含量较高，因此采用甲醇为提取溶剂。对超声提取时间也进行了筛选，超声30 min后，特征成分含量趋于稳定，所以确定超声时间为30 min。

3.4 含量测定结果的分析

在2010年版《中华人民共和国药典》收载的伞形科植物新疆阿魏Ferula sinkiangensis的质量控制中，只有阿魏酸的薄层色谱鉴别，没有成分的含量测定。本研究基于阿魏属植物的特征成分阿魏酸、法尼斯淝醇A、法尼斯淝醇C在阿魏属的多个种如Ferula assafoetida、Ferula persica等均有分离得到，且在抗癌方面具有很好的药理活性，委托沈阳药科大学制备了法尼斯淝醇A、法尼斯淝醇C的单体化合物，经检测，新疆阿魏乙酸乙酯部位法尼斯淝醇A、法尼斯淝醇C的含量均在6%～9%左右，含量较高，可作为新疆阿魏的主要特征有效成分及指标性成分，对新疆阿魏抗癌研究的物质基础与质量控制以及新疆阿魏其他药理药效研究有着十分重要的意义。

对含多种有效成分的新疆阿魏乙酸乙酯部位来说，只测定单一或几种成分，不足以全面反映内在质量。本试验采用梯度洗脱的方法，同时测定3种有效成分的含量，所建立的方法操作简便、重复性好，可用于新疆阿魏乙酸乙酯部位的质量评价，以保证其临床用药的有效性。

[1] 沈冠冕,新疆植物志：第三册[M].乌鲁木齐：新疆科学技术出版社, 2011：578-601.

[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[M].北京：中国医药科技出版社,2010：176.

[3] Kwan-Hyun Kim, Hyo-Jung Lee, Soo-Jin Jeong, et al. Galbanic acid isolated from Ferula assafoetida exerts in vivo anti-tumor activity in association with anti-angiogenesis and antiproliferation[J]. Pharmaceutical Research,2011,28(3)：597-609.

[4] Iranshahi Mehrdad, Kalategi Farhad, Rezaee Ramin, et al. Cancer chemopreventive activity of terpenoid coumarins from Ferula species[J]. Planta Medica,2008,74(2)：147-150.

[5] 周龙龙,张海英,任燕,等.新疆阿魏树脂不同分离部位对结肠癌细胞HCT116的抑制作用[J].中国实验方剂学杂志,2013,19(23)：183-186.

[6] HANAFI-BOJD M Y, IRANSHAHI M, MOSAFFA F, et al. Farnesiferol A from Ferula persica and galbanic acid from Ferula szowitsiana inhibit P-glycoprotein-mediated rhodamine efflux in breast cancer cell lines[J]. Planta Med,2011,77(14)：1590-1593.

[7] LEE J H, CHOI S, LEE Y, et al. Herbal compound farnesiferol C exerts antiangiogenic and antitumor activity and targets multiple aspects of VEGFR1 (Flt1) or VEGFR2 (Flk1) signaling cascades[J]. Mol Cancer Ther,2010,9(2)：389-399.

[8] 夏红兰,姜艳艳,石任兵.百合知母汤有效部位质量控制方法研究[J].中国实验方剂学杂志,2013,19(4)：126-130.

[9] 黄翔,何昱,杨洁红,等.HPLC-DAD法与UV-VIS法对丹红注射液有效成分和有效部位的质量控制研究[J].中华中医药杂志,2013,28(4)：1066-1070.

[10] 周惠芬,邢攀科,张宁,等.HPLC与紫外-可见分光光度计对养阴通脑颗粒有效部位的质量控制[J].中华中医药杂志,2012,27(1)：75-78.

Study on Quality Control of Ethyl-acetate Parts of Ferula Sinkiangensis

ZHANG Hai-ying1,

LI Wei1, ZHOU Long-long2, JIANG Lin1, ZHOU Ming-xin2(1. Affiliated TCM Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830000, China; 2. Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, China)

Objective To establish the method for quality control of ethyl-acetate parts of Ferula sinkiangesis. Methods HPLC was used to detect the contents of ferulic acid, farnesiferol A and farnesiferol C. Waters XTerra RPC18column (250 mm×4.6 mm, 5 µm) was used; acetonitrile-0.1% phosphoric acid was as mobile phase with gradient elution; flow rate was 1.0 mL/min; detective wavelength was 324 nm; temperature was 30 ℃; sample volume was 10 µL Results Ferulic acid, farnesiferol A, and farnesiferol C showed a good linear relationship range from 0.05–1.0 mg/mL, 0.132–2.64 mg/mL, and 0.118–2.36 mg/mL, respectively. The average recovery rates were 99.34%, 98.96% and 99.24% respectively. The contents of ferulic acid, farnesiferol A and farnesiferol C were 33.4, 76.5, 72.3 mg/g respectively. Conclusion The method was simple, accurate and repeatable, with good repeatability and stability, which can be used for the quality control of ethyl-acetate parts of Ferula sinkiangesis.

Ferula sinkiangesis; ethyl-acetate part; ferulic acid; farnesiferol A; farnesiferol C; quality control

10.3969/j.issn.1005-5304.2016.04.022

R284.1

A

1005-5304(2016)04-0083-04

2015-05-20）

（

2015-06-09；编辑：陈静）

国家自然科学基金（81260625）

周铭心，E-mail：zmx9998@vip.sina.com