活血通脉颗粒对颈动脉粥样硬化兔TLR4信号通路及相关炎症因子mRNA表达的影响

谢健，沈超，童晓云，李晓，石安华，陈文玲，叶勇，刘涛，指导：赵淳

1.云南省中医医院，云南 昆明 650021；2.云南中医学院，云南 昆明 650021

活血通脉颗粒对颈动脉粥样硬化兔TLR4信号通路及相关炎症因子mRNA表达的影响

谢健1，沈超2，童晓云2，李晓1，石安华2，陈文玲2，叶勇1，刘涛1，指导：赵淳1

1.云南省中医医院，云南 昆明 650021；2.云南中医学院，云南 昆明 650021

目的 探讨活血通脉颗粒干预颈动脉粥样硬化（carotid atherosclerosis，CAS）斑块形成的机制及对炎症因子表达的抑制作用。方法 将84只兔随机抽取10只为空白组，其余采用高脂饲料喂养建立CAS模型。将成模48只CAS兔随机分为模型组、自然消退组、辛伐他汀组和活血通脉低、中、高剂量组，每组8只。各给药组给予相应药物灌胃，每日1次，连续5周。取颈动脉组织行常规HE染色观察病理变化；免疫组化检测兔颈动脉TLR4的活性表达；荧光定量PCR检测各组TLR4及炎症因子单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、核因子（NF）-κB mRNA表达。结果 模型组颈动脉内膜明显增厚，动脉粥样硬化分布广泛，斑块内含有大量泡沫细胞；免疫组化染色各给药组TLR4阳性染色面积百分比明显低于自然消退组（P＜0.01）；活血通脉高剂量组与辛伐他汀组比较无明显差异；荧光定量PCR检测TLR4、NF-κB、MCP-1 mRNA表达各给药组低于自然消退组（P＜0.05）。结论 活血通脉颗粒可能通过TLR4信号通路干预CAS模型兔斑块形成及对炎症因子表达的抑制作用达到治疗目的。

活血通脉颗粒；颈动脉粥样硬化；TLR4信号通路；单核细胞趋化蛋白-1；核因子-κB；兔

随着人口老龄化加快，颈动脉粥样硬化（carotid atherosclerosis，CAS）发病率不断上升，炎症反应贯穿CAS发病的始终。临床应用活血通脉颗粒治疗CAS，疗效较好[1-2]，但其具体作用机制仍未明确。本实验观察活血通脉颗粒是否通过TLR4抑制炎症因子，从而达到抑制炎症反应、延迟斑块形成、稳定斑块、治疗CAS的作用。

1 材料与方法

1.1 药物

活血通脉颗粒由红景天、虎杖、三七粉、水蛭、茯苓、隔山消等组成，上述饮片均购于云南省中医医院中药房，并由该院制剂中心配制。辛伐他汀片，默沙东制药有限公司，规格40 mg/片，批号K005133。

1.2 动物与饲料

健康新西兰大白兔84只，雌雄不限，3～4月龄，体质量（1.8±0.4）kg，昆明医科大学实验动物学部，合格证号SCXK（滇）2011-0004。饲养于云南中医学院呈贡校区动物实验中心，温度20～26 ℃，湿度40％～60％。高脂饲料由84.5％基础饲料中加入8％猪油、15％蛋黄粉、0.75％胆固醇组成。胆固醇购于安徽天启公司（批号20140316），蛋黄粉购自同和生物公司（批号20130305）。

1.3 主要试剂与仪器

TLR4 Antibody、即用型SABC-POD（兔lgG）试剂盒、抗原修复液及DAB显色液，武汉博士德生物工程有限公司；PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser，SYBR Premix EX Taq™，Takara RNAiso Plus Reagent，Easy dilution，DEPC Free H2O，宝生物工程（大连）有限公司。CS-V1型摊片烤片机（Thermo公司），BM-Ⅷ生物组织包埋机（孝感市宏业医用仪器有限公司），TS-12A生物组织自动脱水机、恒温水浴箱（孝感市宏业医用仪器有限公司），MilliPore超纯水系统（北京医疗设备厂），AB204-S电子分析天平（Mettler-Toledo公司），DS-Fi2光学显微镜（Nikon公司），ABI2720 PCR仪、ABI7500荧光定量PCR仪（美国ABI），Genequant Ⅱ分光光度计（美国Pharmacia）。

1.4 分组、造模及给药

实验兔适应性饲养1周后，随机抽取10只为空白组，其余采用高脂饲料喂养建立CAS模型。造模过程中出现死亡，获得成模兔48只。随机分为模型组、自然消退组、辛伐他汀组和活血通脉低、中、高剂量组，每组8只。自然消退组、辛伐他汀组和活血通脉颗粒低、中、高剂量组以基础饲料饲养5周，每日灌胃1次，均自由饮水。根据临床用药剂量，参照常用实验动物及人的体表面积比例[3]换算。辛伐他汀组每日给予辛伐他汀1.87 mg/kg灌胃，活血通脉低、中、高剂量组每日分别给予活血通脉颗粒5.5、11、22 g原药材/kg灌胃，等体积蒸馏水加热溶解。空白组、模型组和自然消退组予等量蒸馏水灌胃。每日1次，连续5周。

1.5 病理形态学观察

运用空气栓塞法处死动物，造模成功后及给药5周后采集标本。采集颈动脉标本，肉眼观察。再将10％中性缓冲甲醛液对标本灌注，固定24 h后，脱水、透明、浸蜡、包埋、切片（厚5 μm），HE染色。每张切片随机选取5个视野观察组织病理改变。

1.6 免疫组化检测

免疫组化检测CAS斑块中TLR4的表达。用微量移液器吸取一抗（兔多克隆抗体，1∶400）150 μL于组织切片上，放置湿盒中，4 ℃冰箱过夜，二抗（即用型SABC）滴加于组织切片上，SABC复合物工作液孵育，进行DAB显色。细胞浆/细胞膜出现棕黄色沉着为TLR4阳性细胞。使用图像分析软件Image-Pro Plus 6.0 Software测定，每张切片随机选取5个视野，测定每个视野阳性反应面积百分比（阳性面积÷视野面积×100％），取平均值表示阳性染色强度。

1.7 TLR4、单核细胞趋化蛋白-1和核因子-κB mRNA表达检测

按照文献[4]方法提取颈动脉组织总RNA。进行cDNA合成，反转录反应体系。经Primer软件验证引物匹配度，用GAPDH作为参照基因，引物序列如下：TLR-4上游5'-GCCGAAAGGTGATTGTTGTGGTGT-3'，下游5-ACTGCCAGGTCTGAGCAATCTCAT-3'；NF-κB上游5'-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGG-3'，下游5'-TCAACTCCCCTGAAAGGGTCCG-3'；MCP-1上游5'-TGACCCCAAGCAGAAGT-3'，下游5'-TCC GGGTGGAAGATAAAT-3'；GAPDH上游5'-AGAGCA CCAGAGGAGGACG-3'，下游5'-TGGGATGGAAAC TGTGAAGAG-3'。引物长度均为125 bp。实时荧光定量PCR反应体系：SYBR Green PCR master mix 12.5 μL，正向和反向引物各0.5 μL，蒸馏水9.5 μL，cDNA 1 μL混合均匀。每个基因设5个梯度标准品及阴性对照，待测样品2次重复反应。反应条件为：94 ℃、5 min（预变性），94 ℃、30 s（变性），60 ℃、30 s（退火），72 ℃、45 s（延伸），共34个循环。实验数据采用ABI7500 SDS Software分析，用公式2-ΔΔCt方法进行相对定量。能是CAS发生发展的始动机制之一。

TLRs是一组Ⅰ型跨膜受体蛋白质，通过与内、外源性配体结合，激发天然免疫和获得性免疫应答，启动促炎因子的释放，导致炎症反应的发生，在炎症反应的信号转导系统中发挥极其重要的作用。目前人类TLR家族有12名成员已被发现，其中人类血管内皮细胞以表达TLR4为主，尚有少量TLR2；血管外膜的成纤维细胞有大量功能性TLR4，一旦活化能产生大量细胞因子。AS斑块病变处的巨噬细胞和内皮细胞也检测到TLR4和TLR2的表达。TLR4识别内外源性配体后，激活丝裂原激活蛋白激酶和NF-κB通路，启动炎性应答信号通路及诱导炎性因子表达而对机体组织产生保护或损伤作用。越来越多的证据表明，TLR4在AS发生和发展过程中发挥主要作用，TLR4可能是抗AS治疗的新靶点[5]。如Björkbacka等[6]研究发现，TLR下游接头蛋白MyD88缺陷可导致斑块面积减少，脂质浓度下降，细胞因子和化学因子如IL-12、MCP-1等促炎因子的表达下降，而且研究发现TLR4可直接干预巨噬细胞的胆固醇代谢，抑制巨噬细胞的胆固醇外溢，加速巨噬细胞向泡沫细胞的转化，促进AS斑块的形成。亦有研究发现在TLR和apoE双缺陷小鼠模型实验研究中发现模型小鼠主动脉粥样硬化病变范围下降了25％。TLR4激动介导的细胞因子和趋化因子产生增加能刺激细胞的迁移和细胞增殖[7]。Vink等[8]研究提示TLR4激动能促进富含平滑肌的内膜形成，而内膜平滑肌增殖是AS斑块进展的基础。

活血通脉汤是云南省名中医赵淳教授治疗血瘀证经验方。红景天是活血通脉颗粒主要组成之一，其具有抗疲劳、延缓机体衰老、保护心脑血管等功效。沈氏等[9]研究表明，红景天具有抑制AS形成，减少斑块内血管内皮细胞生长因子表达和血管新生的作用。虎杖苷能够通过调节血脂、保护血管内皮、抑制内皮细胞和血管平滑肌增殖等方面发挥抗AS的作用。水蛭有抗血凝、抗血栓形成，降低血液黏度、降血脂的功效。三七有止血、抗血栓、扩血管、抗动脉粥样硬化等作用。

本实验结果显示，各给药组兔颈动脉组织TLR4阳性染色面积百分比与自然消退组比较差异有统计学意义（P＜0.01），活血通脉颗粒高剂量组与辛伐他汀组比较无明显差异。治疗后各组家兔颈动脉组织中TLR4、NF-κB、MCP-1 mRNA表达的相对含量与自然消退组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。我们推测，活血通脉颗粒可能通过干预TLR4信号通路，抑制NF-κB、MCP-1表达，从而起到延迟斑块形成、稳定斑块、治疗CAS的目的。

[1]詹文涛,吴生元,谢健,等.赵淳教授学术思想与临床经验总结[M]//云南师承名老中医学术经验荟萃.昆明：云南民族出版社,2004：358-372.

[2]张磊,唐彬.赵淳教授防治动脉粥样硬化的学术经验[J].云南中医中药杂志,2011,11(4)：8-9.

[3]秦川.实验动物学[M].北京：人民卫生出版社,2010：420-421.

[4]RADFORD G, DONADIO J V, BERGSTRALH E J, et al. Predicting renal out coming in IgA nephropathy[J]. J Am Soc Nephrol,1997,8(2)：199-207.

[5]GENG H L, LU H Q, ZHONG R Q, et al. Increased expression of Toll like receptor 4 on peripheral-blood mononuclear cells in patients with coronary arterioscleorsis disease[J]. Clinical and Experimental Immunology,2006,143(2)：269-273.

[6]BJöRKBACKA H, KUNJATHOOR V V, MOORE K J, et al. Reduced atherosclerosis in MyD88-null mice links elevated serum cholesterol levels to activation of innate immunity signaling pathways[J]. Nat Med,2004,10(4)：416-421.

[7]MICHELSEN K S, WONG M H, SHAH P K, et al. Lack of Toll-like receptor 4 or myeloid differentiation factor 88 reduces atherosclerosis and alters plaque phenotype in mice deficient in apolipoprotein-E[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2004,101(29)：10679-10684.

[8]VINK M, SATO S, HEMMI H, et al. Role of adaptor TRIF in the MyD88-independend toll-like receptor signaling pathway[J]. Science,2003,301(5633)：640-643.

[9]沈伟,范维琥,施海明,等.红景天对兔主动脉粥样硬化斑块内血管内皮细胞生长因子表达及血管新生的影响[J].中国中西医结合杂志, 2008,28(11)：1022-1025.

Effects of Huoxue Tongmai Granules on TLR4 Signaling Pathways and Relevant

Inflammatory Factor mRNA Expression of Rabbits with Atherosclerosis

XIE Jian1, SHEN Chao2,

TONG Xiao-yun2, LI Xiao1, SHI An-hua2, CHEN Wen-ling2, YE Yong1, LIU Tao1, Director: ZHAO Chun1(1. Yunnan Hospital of TCM, Kunming 650021, China; 2. Yunnan University of TCM, Kunming 650021, China)

Objective To discuss the mechanism of rabbit plaque formation of carotid atherosclerosis (CAS) and inhibition of the expression of inflammatory factors. Methods Ten white rabbit randomly selected from 84 white rabbits were set as blank group, and the rest rabbits were fed with high-fat diet for the establishment of CAS models. 48 CAS model rabbits were randomly divided into model group, the natural healing group, simvastatin group, and Huoxue Tongmai Granule low-, medium- and high-dose groups, 8 rabbits in each group. Each medication group was given relevant medicine for gavage, once a day for 5 weeks. Carotid artery tissue routine HE staining was used to observe the pathological changes. Immunohistochemical detection was used for the activity of TLR4 expression in rabbit carotid artery. Fluorescence quantitative PCR was used to detect the TLR4 and the inflammation factor MCP-1, NF-κB mRNA expression. Results The rabbit endometria in model group were obvious thickening; atherosclerosis was widely distributed; a large number of foam cells in plaque were observed. Immunohistochemical in treatment groups showed that TLR4 positive staining area percentage significantly smaller than the natural healing group (P<0.01). There were relatively few differences between Huoxue Tongma Granule high-dose group and simvastatin group. The expressions of TLR4, NF-κB, MCP-1 mRNA in the treatment group were lower than the natural healing group by Fluorescence quantitative PCR detection (P<0.05). Conclusion Huoxue Tongmai Granules achieve therapeutical effect by intervening CAS rabbit plaque formation and inhibiting the expression of inflammatory factors through TLR4 signaling pathways.

Huoxue Tongmai Granules; carotid atherosclerosis; TLR4 signaling pathways; MCP-1; NF-κB; rabbits

10.3969/j.issn.1005-5304.2016.03.013

R285.5

A

1005-5304(2016)03-0047-04

云南省自然科学基金（2011FZ264）；国家中医药管理局赵淳名医工作室研究项目（2013年）

（2015-06-16；编辑：华强）