地屈孕酮对多囊卵巢综合征妊娠大鼠种植窗期PR、ICAM- 1的影响

刘音吟，谈勇，徐菊芳

(1.南京中医药大学，江苏 南京 210023; 2.武警南京医院，江苏 南京 210028)



·论 著·

地屈孕酮对多囊卵巢综合征妊娠大鼠种植窗期PR、ICAM- 1的影响

刘音吟1，谈勇1，徐菊芳2

(1.南京中医药大学，江苏 南京 210023; 2.武警南京医院，江苏 南京 210028)

目的：探讨多囊卵巢综合征(PCOS)大鼠低着床率的可能原因及地屈孕酮在种植窗期的作用机制。方法：80日龄始正常大鼠以生理盐水(NS)、PCOS模型大鼠以克罗米芬(CC)连续灌胃5 d后分别与雄鼠合笼，选取妊娠大鼠随机分为A组(正常妊娠组)、B组(PCOS妊娠组)、C组(PCOS妊娠加地屈孕酮组)3组。于妊娠第5天各组大鼠以酶联免疫吸附法(ELISA)测定雌二醇(E2)、孕酮(P)、肿瘤坏死因子(TNF-)表达水平，免疫组化法测定右侧子宫内膜孕激素受体(PR)、细胞间黏附分子(ICAM- 1)表达水平。结果：种植窗期E2、TNF-表达B、C组高于A组(P<0.05，P<0.01)，P表达C、A组高于B组(P<0.05，P<0.01)，E2/P值3组间差异显著(P<0.05，P<0.01)，PR表达B组低于A组(P<0.05)，ICAM- 1表达B组低于A、C组(P<0.05)；PR与E2、P、E2/P值均无相关性(P>0.05)，ICAM- 1与P呈正相关(P<0.05)，TNF-与E2/P值呈负相关。结论：PCOS大鼠低着床率可能与性激素、TNF-水平异常及低PR、ICAM- 1有关；地屈孕酮可能通过调整P、E2/P值，上调ICAM- 1、PR表达，改善卵巢功能及子宫内膜容受性，提高胚胎着床率。

多囊卵巢综合征； 地屈孕酮； 种植窗期； 孕激素受体； 细胞间黏附分子； 大鼠

多囊卵巢综合征(polycystic ovarian syndrome，PCOS)是生育年龄女性常见的内分泌疾病，是导致无排卵型不孕症的主要因素之一。临床多采用促排卵治疗提高患者的排卵率，但妊娠率仍普遍较低，这可能与其黄体功能不全、子宫内膜容受性差，受精卵与子宫内膜不能同步发育，影响胚胎着床有关。针对这种“高排低孕”的现象，临床常结合孕激素早期黄体支持以减少早期妊娠丢失。子宫内膜仅在一个很短的时间内允许胚胎着床，这一时期子宫内膜容受性达到最高，称为种植窗期。现有研究表明，孕激素受体(PR)、细胞间黏附分子(ICAM- 1)与子宫内膜容受性密切相关[1- 2]，可以作为种植窗期容受性标志物，其表达异常易导致胚胎着床的失败。本研究将围绕种植窗期血清雌二醇(E2)、孕酮(P)、肿瘤坏死因子(TNF- α)及子宫内膜PR、ICAM- 1表达，分析各因素之间相关性，并从子宫内膜容受性角度探讨PCOS大鼠低着床率的可能原因及地屈孕酮提高着床率的可能机制。

1 材料与方法

1.1 动物及材料

1.1.1 实验动物

21日龄断乳雌性SD大鼠40只，80日龄SPF级成年雄性SD大鼠20只，均由南通大学实验动物中心提供，动物许可证号SCXK(苏)2008- 0010。在江苏省中医院动物实验室[动物实验使用许可证号130SYXK(苏)2012- 0047]，采用12 h∶12 h昼夜间断照明，自由采食和饮水，环境温度22～24 ℃。

1.1.2 试剂

脱氢表雄酮(DHEA)：武汉远城科技发展有限公司；克罗米芬(CC)：高特制药有限公司(批号Batch F0201)；Envision免疫组化检测试剂盒：福建迈新生物技术有限公司。

1.1.3 仪器

Leica ASP300S全自动真空组织脱水机，Shandon包埋机、手动切片机及全自动染色机，OLYMPUS显微镜。

1.2 实验方法

1.2.1 建立妊娠大鼠模型及分组

1.2.1.1 建立PCOS大鼠模型 将40只21日龄断乳雌鼠随机分为PCOS模型组30只和正常组10只，适应性喂养2 d。自23日龄开始，PCOS模型组采用改良的Anderson造模法[3]，每天上午颈背部皮下注射DHEA 6 mg·(100 g)-1加0.2 ml注射用大豆油，正常组每日上午颈背部皮下注射0.2 ml注射用大豆油作为对照，两组连续用药30 d造模完成。自注射第20天开始，每天观察阴道涂片，造模结束PCOS模型组大鼠始终处于动情间期，可见阴道上皮呈现持续性角化，无动情周期变化；于造模结束后次日PCOS模型组和正常组全部雌性大鼠眼眶静脉采血，PCOS模型组血清睾酮值升高为造模成功。

1.2.1.2 建立妊娠大鼠模型 自80日龄起，正常组以生理盐水(NS)10 ml·(kg·d)-1、PCOS模型组以CC 4.5 mg加NS 10 ml·(kg·d)-1，每天灌胃1次，连续用药5 d后分别与雄鼠按2∶1合笼，次日检查以发现阴栓记为妊娠第1天(d1)，作为妊娠大鼠模型(正常妊娠模型、PCOS妊娠模型)。

1.2.1.3 妊娠大鼠模型分组 随机选取6只正常妊娠、12只PCOS妊娠模型大鼠分为3组，每组6只：A组(正常妊娠组)：从妊娠d1开始用NS 10 ml·(kg·d)-1灌胃，每天1次，连用5 d；B组(PCOS妊娠组)：从妊娠d1开始用NS 10 ml·(kg·d)-1灌胃，每天1次，连用5 d；C组(PCOS妊娠加地屈孕酮组)：从妊娠d1开始用地屈孕酮1.8 mg加NS 10 ml·(kg·d)-1灌胃，每天1次，连用5 d。

1.2.2 检测方法及指标

1.2.2.1 酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清E2、P、TNF- α表达水平 妊娠大鼠于妊娠d5处死前眼球取血清进行ELISA检测。

1.2.2.2 免疫组化Envision 法检测子宫内膜PR、ICAM- 1表达水平 妊娠大鼠于妊娠d5颈椎脱臼处死。取右侧子宫固定于4%多聚甲醛中，常规脱水，石蜡包埋，Envision法检测子宫内膜PR、ICAM- 1表达，每张切片取5个高倍视野，用Image Pro Plus 5.0.2图像分析软件测定各组光密度(OD)值，计算积分光密度(IOD)。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 3组妊娠大鼠种植窗期血清E2、P、TNF- α表达水平及E2/P值

表1结果显示：E2表达水平A组明显低于B组、C组(P<0.01，P<0.05)，B组与C组间差异无统计学意义(P>0.05)；P表达水平B组明显低于A组、C组(P<0.01)；A组与C组间差异无统计学意义(P>0.05)；E2/P值A组

表1 3组妊娠大鼠种植窗期血清激素、TNF- α的表达

Tab 1 The expression of serum hormone and TNF- α in three groups of rats during the implantation period

组别E2水平P水平E2/P值TNF⁃α水平A组66．686±12．943a2．761±0．616a24．720±5．521a0．935±0．170aB组99．165±18．4971．542±0．39166．431±12．6481．752±0．406C组91．698±19．918b2．543±0．278a36．235±7．992ab1．342±0．286b

a 与B组比较，P<0.01； b 与A组比较，P<0.05

2.2 3组妊娠大鼠种植窗期子宫内膜PR、ICAM- 1表达水平

图1、2及表2结果显示：3组种植窗期PR阳性细胞主要分布于细胞核；ICAM- 1阳性细胞主要分布于细胞浆和细胞膜。A组PR的IOD明显高于B组(P<0.05)；A组与C组、B组与C组间差异无统计学意义(P>0.05)。B组ICAM- 1的IOD明显低于A组、C组(P<0.05)；A组与C组间差异无统计学意义(P>0.05)。

图1 3组妊娠大鼠种植窗期子宫内膜PR免疫组化染色 HE×200

Fig 1 The immunohistochemical staining of PR in endometrium of three groups of rats during the implantation period(HE×200)

2.3 种植窗期子宫内膜PR、ICAM- 1与血清E2、P、E2/P值、TNF- α的相关性

种植窗期子宫内膜PR与E2、P、E2/P值、TNF- α均无相关性(r=0.085、0.057、-0.038、-0.272，均P>0.05)；ICAM- 1与P呈正相关(r=0.583，P<0.05)，而与E2、E2/P值、TNF- α无相关性(r=0.026、-0.450、-0.298，均P>0.05)；TNF- α与E2/P值呈负相关(r=-0.535，P<0.05)，而与E2、P无相关性(r=-0.438、-0.454，均P>0.05)。

图2 3组妊娠大鼠种植窗期子宫内膜ICAM- 1免疫组化染色 HE×200

Fig 2 The immunohistochemical staining of ICAM- 1 in endometrium of three groups of rats during the implantation period(HE×200)

表2 3组妊娠大鼠种植窗期PR、ICAM- 1表达

Tab 2 The expression of serum hormone and TNF- α in three groups of rats during the implantation period

组别PR⁃IOD(×104)ICAM⁃1⁃IOD(×104)A组31．47±9．71a34．68±21．26aB组13．95±10．747．84±6．64C组22．01±7．5617．99±7．47a

a 与B组比较，P<0.05

3 讨 论

胚胎的成功着床取决于胚泡的侵入能力和子宫内膜容受性。E2、P直接作用子宫内膜，合适的E2、P是调节子宫内膜呈现容受状态的重要因素。有研究表明，子宫内膜上很多分子的表达受E2、P调节。PR是子宫内膜容受性的重要标志物[2]，受雌、孕激素的调节。种植窗期子宫内膜PR的正常表达是子宫内膜呈现最大容受性的关键。激素水平及其受体任何一项非正常表达都将影响子宫内膜向黏附状态的转变历程[4]。ICAM- 1是一种重要的细胞黏附分子，余秋波等[5]的研究表明，ICAM- 1基因及蛋白在早孕小鼠子宫内膜上皮细胞、基质细胞、血管上皮细胞均有表达且呈现一定规律性，与胚胎着床有关。TNF- α在适量范围内可刺激细胞滋养细胞的合成，有利于蜕膜细胞外基质降解及胎盘植入，对胎儿的生长和发育是必需的，但TNF- α过度表达可诱导一些有害物质的产生，对妊娠不利[6]。

本研究结果显示，各组妊娠大鼠种植窗期血清TNF- α、子宫内膜PR、ICAM- 1均有表达，但PCOS妊娠大鼠血清P、子宫内膜PR、ICAM- 1表达水平显著低于正常妊娠大鼠、而血清E2、E2/P、TNF- α明显高于正常妊娠大鼠，这说明种植窗期PCOS妊娠大鼠雌孕激素表达异常、TNF- α高表达、子宫内膜PR和ICAM- 1低表达，使子宫内膜与胚胎发育不同步，内膜容受性下降，是导致低着床率的可能原因之一。PCOS妊娠大鼠加用地屈孕酮后，血清P、ICAM- 1水平显著提高、E2/P值显著下降，改善了卵巢功能及子宫内膜容受性，使着床率提高。本研究相关分析结果显示，种植窗期子宫内膜ICAM- 1与P呈正相关，TNF- α与E2/P值呈负相关，因此通过补充地屈孕酮，提高P、降低E2/P值，能在一定程度上上调ICAM- 1水平，调整TNF- α，改善内膜的容受性，这也是加用地屈孕酮提高着床率的可能作用机制。但是，单纯补充地屈孕酮虽能提高血中P水平，却未必能相应增加子宫内膜PR的表达，不能显著提高对孕激素的摄取量，无法完全纠正内膜容受不良的状态及避免早期流产的发生。

在对有生育要求PCOS患者促排治疗中，早黄体期加用地屈孕酮能改善内膜容受性，提高早期妊娠率。在临床治疗中，我们可以结合种植窗期性激素水平评估胚胎着床情况，但是也应该认识到调控胚胎着床的机理非常复杂，受很多因素调控，还有许多未知因子参与其中，因此不能把激素水平高低作为评判胚胎着床与否的单一性指标。同时，我们更应该认识到，对PCOS患者促排卵前调整其内分泌水平，提高子宫内膜容受性，才是减少妊娠丢失的根本手段。

[1] 张炜,周剑萍,刘银坤,等.细胞间黏附分子- 1在小鼠孕早期子宫内膜的表达规律及调节的研究[J].生殖与避孕,2000,20(1)：12- 16．

[2] 冯苗,李素春,潘萍,等.不明原因不孕患者着床窗期子宫内膜形态结构与性激素及其受体表达[J].现代妇产科进展,2009,18(6)：437- 439．

[3] ANDERSON E,LEE G Y.Polycystic ovarian condition in the dehydroepiandrosterone- treated rat model:hyperandrogenism and the resumption of meiosis are major initial events associated with cystogenesis of antral follicles[J].Anat Ree,1997,249(1):44- 53．

[4] 李莉,章汉旺,邓彧,等.来曲唑与克罗米芬促排卵对小鼠子宫内膜形态学和雌孕激素受体表达的影响[J].中国妇幼保健杂志,2008,23(10)：1411- 1433．

[5] 余秋波,何俊琳,李红梅,等.早孕小鼠子宫内膜ICAM- 1的表达及意义[J].西南大学学报：自然科学版,2007,29(2)：32- 35．

[6] 王玲.助孕宁I号方治疗Th1/Th2失衡的肾虚型不明原因复发性流产的应用研究[D].哈尔滨：黑龙江中医药大学,2012．

Effect of dydrogesterone on progesterone receptor and intercellular adhesion molecule- 1 in pregnant rats with polycystic ovarian syndrome in planting window period

LIU Yin- yin1，TAN Yong1，XU Ju- fang2

(1.Nanjing Traditional Chinese Medicine University，Nanjing 210023，China；2.ArmedPoliceHospitalofNanjing，Nanjing210028，China)

Objective： To investigate the possible reasons for low rate of implantation in rats with polycystic ovarian syndrome(PCOS)and the influence mechanism of dydrogesterone on implantation rate of PCOS rats. Methods: From the 80th day after birth， normal rats were given normal saline(NS) and PCOS rats model were given clomiphene(CC) for five consecutive days. Then they were mated with male rats. The pregnant rats were selected and divided into three groups with 6 in each group: group A(normal pregnant rats); group B(PCOS pregnant rats); group C(PCOS pregnant rats with dydrogesterone).On the 5th day of pregnancy， the levels of E2，P and TNF- α in each group were determined by ELISA ， and the expression levels of progesterone receptor(PR) and intercellular adhesion molecule- 1(ICAM- 1) in endometrium were detected by immunohistochemistry. Results: In planting window period ，the levels of E2 and TNF- α in group B and C were higher than those in group A(P<0.05，P<0.01)；the levels of P in group A and C were higher than those in group B(P<0.05，P<0.01). The values of E2/P in the three groups were significantly different(P<0.05，P<0.01).The expression of PR in group B was lower than that in group A(P<0.05)， and ICAM- 1 expression levels in group B were lower than those in group A and C(P<0.05). PR expression had no correlation with E2， P and E2/P(P>0.05).ICAM- 1 was positively correlated with P， while TNF- α was negatively correlated with E2/P. Conclusion: Low rate of implantation in PCOS pregnant rats was probably associated with abnormal sex hormone levels， TNF- α and decreased expression of PR and ICAM- 1.Dydrogesterone can possibly improve the rate of implantation through adjusting P and E2/P， upregulating ICAM- 1 and PR expression， and improving ovarian function and the receptivity of endometrium.

polycystic ovarian syndrome; dydrogesterone; implantation; progestrone receptor; intercellular adhesion molecule- 1; rats

2016- 04- 01

2016- 05- 01

江苏省中医药科技项目(LZ11182)

刘音吟(1978-)，女，江苏常熟人，讲师，在读博士研究生。E- mail：liuyinyin2005@163.com

谈勇 E- mail:xijun1025@163.com

刘音吟，谈勇，徐菊芳.地屈孕酮对多囊卵巢综合征妊娠大鼠种植窗期PR、ICAM- 1的影响[J].东南大学学报：医学版，2016，35(4)：514- 518.

R- 33； R711.75

A

1671- 6264(2016)04- 0514- 05

10.3969/j.issn.1671- 6264.2016.04.009