猪流行性腹泻病毒(PEDV)XJ-DB2株对25日龄仔猪毒力试验

杜久斌 ， 贺 笋 ， 刘小兰 ， 程兰玲 ， 张 迪 ， 李延涛 ， 李盛东 ， 袁 科

(新疆天康畜牧生物技术股份有限公司 ， 新疆乌鲁木齐830001)



猪流行性腹泻病毒(PEDV)XJ-DB2株对25日龄仔猪毒力试验

杜久斌 ， 贺 笋 ， 刘小兰 ， 程兰玲 ， 张 迪 ， 李延涛 ， 李盛东 ， 袁 科

(新疆天康畜牧生物技术股份有限公司 ， 新疆乌鲁木齐830001)

用生理盐水将猪流行性腹泻病毒细胞分离毒株XJ-DB2株稀释成含104、105和106TCID50(病毒半数细胞感染量)3个剂量组。将16头25日龄健康易感仔猪随机分成4组，每组4头。前3组分别口服1 mL含有104、105TCID50和106TCID50PEDV XJ-DB2株病毒液作为攻毒组，最后1组作为阴性对照口服同等量的生理盐水。相同条件下隔离饲喂，连续观察7 d，攻毒组全部出现猪流行性腹泻临床症状，对照组则无任何临床症状。第7天全部剖杀，观察肠组织病理变化。剖检结果显示：104TCID50剂量组中有3头猪肠组织均有明显病变(肠壁变薄、臌气，肠内充满黄色液体)而另外1头猪肠组织无明显病变；105TCID50和106TCID50两个剂量组8头仔猪肠组织均出现明显病变；阴性对照组4头仔，猪肠组织均无病变。由此判断XJ-DB2株为PEDV强毒株，以104TCID50剂量口服可以致25日龄仔猪发病。

仔猪 ； PEDVXJ-DB2株 ； TCID50； 临床症状 ； 病理变化

猪流行性腹泻仅发生于猪，各个年龄段猪均可感染发病。哺乳仔猪、保育小猪和肥育猪的发病率很高，但以哺乳仔猪受害最为严重，母猪发病率变动很大，约为15%～90%。病猪是主要传染源，病毒存在于肠绒毛上皮和肠系膜淋巴结，随粪便排出后，污染环境、饲料、饮水，以及交通工具及用具而传染。

经人工发病试验，猪口服PEDV后，潜伏期一般为20 h至3 d。在实验室，新生仔猪最早有接种8 h后就开始发病的，病毒在小肠绒毛上皮细胞内繁殖，在16～30 h达到最大量。由于病毒的侵袭，小肠上皮细胞变性、绒毛脱落，导致小肠内酶活性明显下降，扰乱了消化及细胞运输营养物质和电解质，引起急性吸收不良。对哺乳仔猪而言，就不能消化乳中的乳糖和蛋白质，使肠内产生高渗，液体在肠内滞留，甚至从组织内吸收液体，进而导致腹泻和脱水，酸中毒而死亡[1]。

本试验通过对25日龄仔猪口服PEDVXJ-DB2株，研究分离毒株XJ-DB2株对猪致病性的强弱。

1 材料与方法

1.1 材料 细胞：非洲绿猴传代肾细胞(Vero)由本实验室保存。病毒：PEDV分离毒XJ-DB2株由本实验室分离保存。细胞培养基及血清：细胞培养基MEM和胎牛血清，均购自Hyclone公司。实验动物：25日龄健康易感仔猪(猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎、猪轮状病毒抗原阴性，猪流行性腹泻中和抗体效价不高于1∶4)，与15日龄时断奶，隔离单独饲养，饲喂颗粒猪饲料。

1.2 方法

1.2.1 PEDV TCID50的测定将PEDV DB2株细胞传代毒解冻。用DMEM培养基将病毒作连续10倍稀释，即10-1、10-2……每个稀释度取100 μL加入96孔细胞培养板中，随后加入经0.25%胰酶消化的感染的宿主细胞100 μL(细胞含量以105/mL左右为宜)每个稀释度作8个重复，并设空白细胞培养对置37 ℃ 5%CO2培养箱中。逐日观察细胞病变，并记录细胞病变孔数，连续观察5 d。用Reed-Muench法计算病毒的TCID50。

1.2.2 试验仔猪中和抗体的测定 按1.2.1中方法进行病毒液TCID50的测定。将测定好TCID50的毒液稀释成200个TCID50的病毒悬液。在96孔微量培养板中将血清(预先56 ℃灭活30 min)作连续倍比稀释(具体方法是在96孔板中先加入50 μL生长液，再加50 μL待检血清，混匀后，吸50 μL至下一孔，如此下去。一直到1∶256)每个稀释度作4孔。在上述各孔内加入50 μL稀的病毒液，混匀。同时设待检血清毒性对照，阴、阳性血清对照，病毒对照和正常细胞对照，其中病毒对照要作200个TCID50、20个TCID50、2个TCID50、0.2个TCID504个不同浓度。将96孔细胞培养板放入37 ℃ 5% CO2培养箱中作用45 min～60 min。感作完成后每孔加入 100 μL 细胞悬液，继续置37 ℃ 5% CO2培养箱中培养，逐日观察并记录结果，一般观察5～6 d。结果计算，按Reed-Muench两氏法或Ksrber法进行计算。

1.2.3 攻毒 将试验仔猪随机分成4组，每组4头。分别用104、105、1063个剂量PEDV分离毒XJ-DB-2株和生理盐水1 mL对4个试验组仔猪进行口服，相同条件下饲喂，连续观察7 d并记录临床症状。

1.2.4 剖检 7日后所有猪只剖检观察肠组织病理变化。

2 结果

2.1 PEDV TCID50PEDV分离毒株DB-2株19代细胞毒TCID50=1.0×106/mL。

2.2 试验仔猪攻毒前PEDV抗体 16只25日龄仔猪血清检测中和抗体均不高于1∶4。

2.3 临床症状 所有仔猪在攻毒后观察临床症状变化，攻毒组仔猪出现明显的临床症状呕吐、腹泻、脱水等症状，而阴性对照组均无临床症状。每头仔猪的临床观察结果见表1。

2.4 剖检结果 通过剖检发现，104TCID50攻毒剂量组有3头仔猪出现明显的肠组织病变(肠壁变薄、臌气、内充满黄色液体或泡沫)1头则无明显的肠病变。105、106TCID50两个剂量组，8 头仔猪都出现明显的肠病变。阴性对照组肠组织正常。

表1 攻毒后仔猪临床症状观察结果

3 讨论

本试验选取25日龄猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎、猪轮状病毒抗原阴性，猪流行性腹泻中和抗体效价不高于1∶4仔猪进行毒力试验，分别用3个剂量(104、105TCID50和106TCID50)的PEDV XJ-DB2株分离病毒进行口服攻毒，通过临床症状观察，3个攻毒组部分仔猪在20 h左右部分猪出现呕吐症状，且呕吐物中含有泡沫，特别是进食或饮水后。30 h左右出现腹泻、震颤、行动迟缓等症状。70 h攻毒组仔猪全部表现精神沉郁、嗜睡、扎堆、驱赶不动，行动迟缓，站立震颤、腹泻、脱水等症状，部分呕吐仔猪症状变轻或消失。在整个发病过程中，每头攻毒仔猪虽然发病程度轻重不同，但都会出现腹泻症状。25日龄仔猪攻毒后，呕吐物为黄色液体，腹泻物为黑色黏稠水样液体，这与两周龄内仔猪症状不同(两周龄内仔猪呕吐物为黄色液体，有凝乳块。腹泻物为黄色或黄绿色液体[2])这可能与仔猪的饮食、日龄有关，其他症状均与两，周龄内仔猪感染PEDV症状相同。

剖检104TCID50攻毒剂量组肠组织病变有1头轻微，其余3头肠组织病变很明显，105、106TCID50攻毒剂量组8头仔猪肠组织病变明显，阴性对组4头肠组织正常。所有仔猪肠病变主要体现在小肠部分，与报道的猪流行性腹泻病毒在人工感染仔猪体内的分布中剖检结果相一致[3]，PEDV XJ-DB2株只引起猪的局部感染。

综上所述，PEDV XJ-DB2株细胞适应毒株为强致病性毒株，结合临床症状和剖检肠病变程度我们认为104TCID50剂量可致25日龄仔猪发病，至于更低的剂量能否使25日龄仔猪发病还需进一步验证。

[1] 钱永清，邹勇，何锡忠，等.猪流行性腹泻、传染性胃肠炎和猪轮状病毒病及其防治[J].猪病防治与保健，2004，6：28-31

[2] 王增计.冬季养猪谨防猪流行性腹泻[J].北方牧业，2012(2)：20.

[3] 杨臣，猪流行性腹泻病毒在人工感染仔猪体内的分布[J]．中国人民解放军兽医大学学报，1986，6(1)：21-25.

2015-06-18

杜久斌(1979-)，男，兽医师，本科，从事动物疫苗研发工作，E-mail：229895232@qq.com

贺笋，E-mail：18646206@163.com

S852.65+1

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0529-6005(2016)10-0027-02