猪瘟病毒流行毒株遗传演化分析与免疫对策

吴家强/山东省农业科学院畜牧兽医研究所

猪瘟病毒流行毒株遗传演化分析与免疫对策

吴家强/山东省农业科学院畜牧兽医研究所

一、猪瘟与猪瘟病毒概况

1. 猪瘟（CFS）。国际兽医组织（OIE）规定的一类烈性传染病之一。在临床上，以高热稽留，和多器官广泛性出血为主要临床特征。猪是唯一易感动物，不同品种不同日龄的家猪和野猪对猪瘟病毒都是高度易感，根据猪瘟的临床特征和发病程度可将本病分为最急性、急性、慢性、温和型四种。随着我国C株疫苗（政府规定强制免疫性疾病之一）广泛使用，典型猪瘟在临床上较为少见，症状与病变不典型，在临床上易误诊，这时需要借助实验室手段进行诊断。

未免疫猪瘟疫苗的发病猪，外观看皮肤苍白、贫血，皮肤下有紫色点状出血斑。慢性猪瘟：耳朵皮肤出现坏死。大肠粘膜纽扣状溃疡。急性猪瘟：肠道粘膜大量出血。典型猪瘟：喉头粘膜和扁桃体出血，脾脏边缘出血性梗死。

猪瘟：淋巴结出血，呈大理石状。怀孕母猪流产、死胎。

有些病例出现在规模化猪场，在临床上，猪瘟也是造成母猪繁殖障碍的疾病之一。

2. 猪瘟病毒（CFSV）。属于黄病毒科、瘟病毒属，基因组是单股正链RNA病毒，基因组的全长是有感染性的。猪瘟病毒与牛腹泻病毒有共同抗原。在培养病毒的时候，分离猪瘟病毒尽量用马的提，不用牛的去提。用牛的去提，可能会感染BVDV病毒，在猪瘟病毒分离的时候可能会得出假阴性的结果，换成马血清，20%，会很容易解决这个问题。

猪瘟病毒的基因组长约12.3 kb，含有1个ORF，产生4个结构蛋白和7个非结构蛋白，其中猪瘟的E2蛋白是比较重要的免疫蛋白，可以诱导素产生综合抗体，起到很好的免疫防疫作用。可分为3个基因型（1型，2型和3型），11个基因亚型（1.1-1.4；2.1-2.3；3.1-3.4）。

二、近年山东地区猪瘟检测与分析

2015年，山东省地区猪场出栏头数为4 995万头，位居全国第四位。

近四年，从2013～2014年，我们山东地区猪瘟的抗原检测结果，在这四年里我们一共检测了2 634份猪瘟一次样品，通过PCR检测和测序分析，其中猪瘟阳性样品421份，猪瘟抗体的阳性率达到15.98%。

采集了没有免疫的小猪样品和免疫猪瘟疫苗两周后的样品，从时间上来说，可以规避猪瘟毒株，临床感染率为15.98%。2014年采集了624份猪瘟一次样品，其中猪瘟抗原阳性样品161份，猪瘟抗原阳性率达到25.80%，这个数据远远高出近四年的平均水平，因此我们提出假设，在此期间猪瘟病毒发生了一次大的变异，导致这一次的流行。在之后研究中，我们也得到了证实，2014年前后，猪瘟处于基本稳定状态，也是这个时间段，亚型发生了改变，从2.1 b变成2.1 d。

2013～2016年一共采集了10 002份血清样品，其中猪瘟抗体阳性样品6 961份，抗体阳性率达到69.60%，此数据接近合格数（国家农业部规定猪瘟群体的抗体检测结果阳性率达到70%为合格），2015和2016年山东的猪瘟抗体平均水平都超过了70%。根据我们的检测，还有其他大型猪场的猪瘟抗体水平在80 %以上，一些散养户和小规模猪场的抗体水平相对较低。

三、猪瘟病毒遗传进化分析

在样品检查测序的基础上，近一步做了猪瘟病毒的遗传进化分析，在2014～2016年共分离、鉴定28株猪瘟病毒，并对其中2株进行了全基因组测序，28株毒株的E2基因全部进行测序。

2014年共分离到10株猪瘟病毒，其中8株是2.1 b亚型，2株是2.1 d 亚型（占总比20 %），2015年共分离到10株猪瘟病毒，其中1株是2.1 b亚型，9株是2.1 d亚型（占总比90 %），2014～2015年，发生急剧的变化。2016年上半年共分离到8株猪瘟病毒，综合测序全部是2.1 d亚型（100%），2014年山东地区猪瘟阳性率的急剧上升，与猪瘟毒株的转型是有很大关系的，导致疫苗不完全保护。我们进一步做了猪瘟病毒的遗传进化的分析，从14年到16年分离出的猪瘟病毒大部分是2.1 d亚型，在2014年以前，少部分毒株是2.1 b亚型。

2014年到2015年猪瘟病毒发生了变异。

猪瘟病毒遗传进化小结与推测：猪瘟病毒2.1 d亚型已经替代2.1 b亚型，成为当前猪群新的猪瘟流行毒株。与1.1亚型的猪瘟兔化弱毒疫苗毒株相比，2.1 d亚型序列发生了很大程度的变异，其中E2蛋白的核苷酸同源性只有82%左右，氨基酸序列同源性不足90%。2.1 d亚型正朝着远离猪瘟兔化弱毒疫苗的方向进化，那么当前疫苗是否还能够完全保护2.1 d亚型毒株的攻击。

四、猪瘟病毒2.1 d亚型免疫攻毒试验

1.病毒-血清型中和试验。采用抗疫苗毒株的血清，分别中和猪瘟兔化毒株疫苗和2.1亚型毒株，在PK-15细胞上测定，中和抗体效价分别为1∶256和1∶16，差异极显著。

2.猪瘟疫苗对2.1 d亚型的交叉保护试验设计。

注：猪瘟脾淋苗购自国内某疫苗厂家，含量为300RID/头份；政府采购猪瘟活疫苗（脾淋源）质量标准中的效力试验规定，每头份猪瘟脾淋疫苗作1;150稀释，免疫无猪瘟中和抗体的健康仔猪，用强毒株攻毒，免疫仔猪全部健活（或稍有提问反应，但无猪瘟临床症状）为合格。

3. 猪瘟病毒2.1 d亚型免疫攻毒小结。疫苗免疫血清中和2.1 d亚型的能力降低，SDZP01攻毒可引起部分免疫株中和抗体延迟，持续高病毒血症，并引起猪发病，出现较为典型的病变和组织病理学变化，但其致病性比1.1亚型的Shimen株弱。

五、猪瘟免疫对策

1. 猪瘟疫苗免疫遇到的问题。仔猪首免与二免时间是否必须在20/60日龄。疫苗免疫剂量是一头份还是加倍。为什么保育猪群的猪瘟抗体水平低下。母猪免疫疫苗是跟胎免疫还是普防。疫苗有BVDV污染是否影响抗体水平。用以下两个猪瘟疫苗使用的临床案列来解析。

案例一：母猪存栏2 400多头，年出栏商品猪近50 000头。防疫猪瘟、伪狂犬病、口蹄疫（以上三病均普防，1次/3个月)、猪蓝耳病（母猪使用进口弱毒疫苗，普免4次；仔猪使用国产弱毒疫苗，免2次），饲料中定期添加氟苯尼考、替米考星、支原净等药物进行保健。自2014年2月开始暴发疫情，仔猪陆续发烧，体温41℃，皮肤出血点或出血斑，呼吸困难，部分仔猪有腹泻和水肿症状，部分仔猪有神经症状，死亡率50～100%。剖检可见肾脏、心脏、脾脏、后头、膀胱等器官点状出血，淋巴结切面大理石样出血；肠道浆膜和粘膜出血，肠系膜水肿，腹腔有胶冻样渗出液。

猪瘟发病原因分析。猪瘟疫苗含量不准确，由450RID下降为150RID。猪场免疫程序不合理。感染PRRS、PCV2等疾病，免疫功能下降。缺乏有效的免疫监测手段。

猪场免疫程序调整与优化。鉴于主群目前的猪瘟和蓝耳病感染情况， 发病场的免疫程序调整如下：

经产母猪分别于产后23天、配种后23天各注射一次猪瘟疫苗；仔猪超前免疫1头份猪瘟疫苗，25日龄和65日龄再各免疫一次猪瘟单苗。严格把关猪瘟疫苗的质量，采购前先让厂家送检猪瘟疫苗的样品，经实验室测定抗原含量，合格后再采购同一批次的疫苗入库保存。

经产母猪产后15日龄，分别给母猪和15日龄仔猪各注射1头份猪瘟蓝耳病疫苗。经产母猪不再实施普免（原来防疫程序是4月、8月、12月各一次），仔猪第二针蓝耳病疫苗（35日龄），统一停掉。

案例二：基础母猪存栏1 000头，年出栏商品猪18 000头，母猪跟胎防疫猪瘟脾淋疫苗（产后25天免疫2头份，间隔1个月加强免疫2头份）。仔猪21日龄首免1头份，60日龄加强免疫1头份。保育猪饲料中添加强力霉素、支原净等药物进行保健。

存在的问题。仔猪和保育猪猪瘟抗体阳性率低下，而且参差不齐，三分之一的仔猪首免猪瘟疫苗后发生过敏反应。部分仔猪发生疑似猪瘟感染，剖检可见肾脏、肺脏、膀胱等气管出血；淋巴结切面大理石样出血。经实验室诊断为猪瘟感染。

2.猪瘟免疫的对策。仔猪的首免日零不应该千篇一律，应该根据各个猪场母源抗体的消长规律制定。母猪跟胎免疫的猪瘟抗体水平优于普防。降低猪群蓝耳病的带毒量或减少蓝耳病疫苗的用量和频次，有助于提高猪群的猪瘟抗体水平。对使用的疫苗进行定量检测，并定期对不同猪群进行猪瘟抗原和抗体监测，为调整优化猪瘟免疫程序提供参考依据。（本文根据会议录音整理，未经专家本人审阅，如有出入，以专家意见为准。）