谷子淀粉结合域蛋白基因家族序列特征及干旱胁迫响应表达分析

王晶蓉，付荣，张泽，李红英,2,3*，侯思宇,3

(1.山西农业大学 农学院，山西 太谷 030801； 2.农业部黄土高原作物基因资源与种质创制重点实验室，山西 太原 030031； 3.山西农业大学 生物工程研究所，山西 太谷 030801)



谷子淀粉结合域蛋白基因家族序列特征及干旱胁迫响应表达分析

王晶蓉1，付荣1，张泽1，李红英1,2,3*，侯思宇1,3

(1.山西农业大学 农学院，山西 太谷 030801； 2.农业部黄土高原作物基因资源与种质创制重点实验室，山西 太原 030031； 3.山西农业大学 生物工程研究所，山西 太谷 030801)

[目的]谷子属于耐旱杂粮作物，但谷子响应干旱胁迫的相关基因分子机制仍不清楚。为了明确谷子干旱胁迫是否与淀粉代谢关键酶基因相关，探索谷子抗旱的分子机制。[方法]运用生物信息学初步分析了谷子该家族基因的基本序列特征、启动子元件预测。构建该基因家族直系同源系统进化树，分析与其他物种同源蛋白的亲缘关系。基于数字基因表达谱数据分析了PEG模拟干旱条件下，该基因家族在谷子抗旱品种‘勾勾母鸡咀’和敏感性品种‘晋汾16’的表达特征。[结果]谷子全基因组调查表明该基因家族有五个成员，暂且命名为SiSBD1、SiSBD2、SiSBD3、SiSBD4和SiSBD5。序列分析表明， 该基因家族成员编码的蛋白序列长度范围为360～949个氨基酸残基；蛋白分子量范围为39～108 kD，蛋白质等电点为4.18～6.72。启动子元件分析鉴定出与抗旱相关的顺式作用元件，主要包含：与MYB抗旱基因调控相关，与MeJA、ETH、SA、ABA等在抗旱中起重要作用的植物激素相关，与植物防御和非生物胁迫响应相关。系统进化树表明，谷子SiSBD1基因与高粱和玉米同源蛋白SBD聚为一类，谷子SiSBD2基因与玉米SBD2、SBD3基因的聚为一类，其他3个基因归为一类。进一步分析PEG胁迫下谷子淀粉结合域蛋白基因家族表达，结果表明：SiSBD1在抗旱品种‘勾勾母鸡咀’中表达增加，在敏感性品种‘晋汾16’中表达降低，而其他4个基因的表达在这两个品种中均降低。[结论]该研究结果暗示了淀粉代谢关键酶SDB基因家族与干旱胁迫相关，可为谷子抗旱育种提供一定的理论基础。

谷子；STBD；CGTase；GAA；抗旱性；分子机制

谷子(Setariaitalica)，是禾本科狗尾属作物，起源于中国，属于耐旱稳产作物。已有研究报道表明，谷子根系发达，叶片细窄，水分利用率高，蒸腾系数较小[1]，因此，谷子具有较强的抗干旱能力。在我国，谷子种植区域主要集中在北方黄河流域中上游的干旱、半干旱地区。其中，河北省、山西省和内蒙古自治区是种植面积较大的3个省(区)，而这些地区常年面临着严重干旱问题[2]。因此，选育抗旱能力强、品种适应性广兼有淀粉含量高的谷子品种是将来育种的主要研究方向。

植物在干旱胁迫下，可溶性糖通常作为品种抗旱性评价指标之一，通常抗旱性强品种相比抗旱性弱品种，能保持较高的可溶性糖含量并有较强的光合以及干物质合成能力，形态上表现为受害比较轻、产量相对较高。另外可溶性糖含量同产量、抗旱指数均呈显著正相关；进一步说明了抗旱性强的品种有较强的协调代谢及保水能力[3]。而植物中可溶性糖的积累会促进可溶性淀粉含量的增加。因此研究干旱胁迫下，解析谷子淀粉代谢相关基因及表达模式，可间接反映淀粉合成的底物，即可溶性糖含量的变化模式，从而为谷子干旱胁迫调控淀粉代谢分子机制的研究提供一定的理论参考价值。淀粉结合域蛋白(Starch binding domain protein, SBD)包含了多种淀粉代谢的关键酶，如淀粉合成酶Ⅲ(Starch synthase III)。已有研究报道，过表达淀粉结合域蛋白中的4个成员(SBD2-SBD5)在土豆中，结果导致小淀粉粒的合成和表达[4]。此外，国内外该方面的研究报道几乎为空白。

由于谷子抗旱方面的研究大多集中在生理生化方面，而谷子淀粉合成酶与抗旱相关的分子机制研究较少。因此，本研究针对谷子淀粉代谢途径中关键的淀粉合成酶，即SBD基因家族进行序列特征分析，并初步分析PEG诱导条件下该基因家族各成员在抗旱品种‘勾勾母鸡咀’和干旱敏感品种 ‘晋汾16’中的表达特征，以期找到与干旱胁迫响应的谷子SBD基因，为进一步选育优质谷子淀粉积累兼抗旱品种提供理论参考和科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为抗旱品种‘勾勾母鸡咀’(GG)和干旱敏感品种‘晋汾16’(JF-16)，由山西农业大学生物工程研究所储藏保存。

1.2 试验方法

1.2.1 谷子中SBD蛋白生物信息学分析

在NCBI中文献查找谷子SBD基因(Genbank ID：XM_004961860)的序列，同时，全基因组同源蛋白搜索Phytozome网站(http://www.phytozome.net/)调取谷子基因组中的所有同源基因氨基酸序列。利用DNAMAN 6.0软件预测蛋白质分子量和等电点。利用MEGA6.0进行多序列比对，并利用这些序列的氨基酸序列构建系统发育树分析其进化关系。利用PlantCARE网站(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)对谷子SBD基因的起始密码子上游3 000个核苷酸进行启动子顺式作用元件预测分析。

1.2.2 基因表达分析

对供试材料GG和JF-16釆用20% PEG-6000模拟干旱法进行处理[5]，三次生物学重复。将生长3周的植株转移至20% PEG-6000溶液中进行模拟干旱胁迫0.5 h，对照为蒸馏水处理，每个样品取3株材料，液氮速冻，提取RNA[5]。所有实验材料均在山西农业大学农学院温室中进行，光照强度为250 μmol·m-2·s-1, 昼夜温度分别为28 ℃和23 ℃，昼夜光照时间分别为16 h和8 h。基于qPCR的方法鉴定分析SBD基因家族的各个成员在抗旱品种GG和干旱敏感品种JF-16谷子中的相对表达量。

2 结果与讨论

2.1 谷子SBD基因家族成员序列特征

全基因组搜索分析，谷子SBD基因家族中有5个基因，分别为SBD1(Genbank ID：XM_004961860)、SBD2(Genbank ID：XM_004970574)、SBD3(Genbank ID：KQK91304)、SBD4(Genbank ID：KQK99326)和SBD5(Genbank ID：KQK92471)。暂且将这些基因命名为SiSBD1、SiSBD2、SiSBD3、SiSBD4和SiSBD5。

SiSBD1基因，位于‘豫谷1号’基因组第3号染色体，基因组核酸序列全长为3 043 bp，cDNA序列长度为2 232 bp，编码区长度为1 083 bp，编码360个氨基酸残基。包含4个内含子，长度分别为96 bp、93 bp、88 bp和534 bp。基因注释为糊精葡聚糖转移酶(Cyclomaltodextrin glucanotransferase, CGTase)。CGTase是一种多功能型酶，它能催化四种不同的反应：三种转糖基反应(歧化反应、环化反应和偶合反应)和水解反应[6]。而且CGTase能通过环化反应利用淀粉生产环糊精和一些直链低聚糖，也会产生一定量的极限糊精[7]。

SiSBD2基因，位于‘豫谷1号’基因组第5号染色体，基因组核酸序列全长为 2 666 bp，cDNA序列长度为2 235 bp，编码区长度为1 026 bp，编码341个氨基酸残基。包含4个内含子，长度分别为169 bp、118 bp、73 bp和71 bp；5个外显子，长度分别为201 bp、70 bp、176 bp、357 bp和222 bp。基因注释为溶酶体α-葡糖苷酶(Lysosomal alpha-glucosidase, GAAase)。GAAase可以从低聚糖类底物的非还原末端切开α-1,4糖苷键，释放出葡萄糖，或将游离出的葡萄糖残基转移到另一糖类底物形成 α-1,6糖苷键，从而得到非发酵性的低聚异麦芽糖或糖酯、糖肽等[8,9]。

SiSBD3基因，位于‘豫谷1号’第9号染色体，基因组核酸序列全长为9 935 bp，cDNA序列长度为2 641 bp，编码区长度为2 172 bp，编码723个氨基酸残基，包含23个外显子和22个内含子。基因注释为果糖-2,6-二磷酸酶(Fructose-2,6-bisphosphatase，PFKase)。PFKase存在于细胞质中，参与很多代谢反应，将果糖-2,6-二磷酸转变成果糖-6-磷酸，在糖的异生代谢和光合作用同化物蔗糖的合成中起关键性的作用。

SiSBD4基因，位于‘豫谷1号’第7号染色体，基因组核酸序列全长为8 649 bp，cDNA序列长度为2 697 bp，编码区长度为2 307 bp，编码768个氨基酸残基。包含23个外显子和22个内含子。编码6-磷酸果糖激酶-2(Phosphofructokinase 2 , PFKase2)。PFKase2催化6-磷酸果糖转变合成2,6-双磷酸果糖，后者经 FBPase-2 催化可降解产生6-磷酸果糖及磷酸，对植物体内糖酵解过程有阻遏作用[10]。

SiSBD5基因，位于‘豫谷1号’第9号染色体，基因组核酸序列全长为8 249bp，cDNA序列长度为3 999 bp，编码区长度为2 850 bp，编码949个氨基酸残基，包含22个外显子和22个内含子。基因注释为4-α-葡聚糖转移酶(4-alpha-glucanotransferase, AGTaes)。AGTaes酶是自然界广泛存在的一大类酶，同时它是一种多功能酶，4-α-糖基转移酶是具有歧化、环化和水解等活性的多种催化功能机制的酶，通过这些酶活性物质，可以对天然的淀粉分子进行结构的改造，从而优化淀粉的理化性质。4-α-糖基转移酶是生物的体内淀粉代谢过程中所需的酶里面最重要的酶之一。4-α-糖基转移酶简单来讲主要催化α-1,4-糖苷键的断裂，催化α-葡聚糖残基在分子内或者分子间的转移，完成转糖基反应。还可以轻度水解连接支链淀粉丛的主链，这就使淀粉的分子量下降，并伴有少量的不同聚合度的环状葡聚糖的生成[11]。

2.2 谷子SBD基因家族成员蛋白质理化性质

该基因家族成员编码的蛋白序列长度范围为360～949个氨基酸残基；蛋白分子量范围为39～108 kD，蛋白质等电点为4.18～6.72(表1)。蛋白质分子量和等电点的变幅暗示该基因家族成员的蛋白空间结构不同和功能的多样性。

表1 SBD基因家族成员蛋白理化性质

2.3 谷子SBD基因家族成员亲缘关系分析

物种的进化关系通常用比较直观的系统进化统树(Phylogenetic tree)来表示。主要根据同源性之间的差异对物种或分子之间的进化关系进行评估，从而我们可以了解基因的起源、进化性。将谷子SBD基因编码的蛋白序列与来源于高粱、玉米的SBD同源蛋白序列进行比对及系统进化树分析(图1)。结果表明：谷子两个SBD基因在进化关系上与玉米及高粱直系同源蛋白聚为一类，暗示该基因家族的成员SiSBD1和SiSBD2与玉米和高粱同源蛋白亲缘关系较近且进化保守。而谷子SiSBD3、SiSBD4和SiSBD5基因单独聚为一类，结果暗示这3个基因尽管与其他禾谷类作物亲缘关系相近，但进化过程中彼此之间存在较多氨基酸序列的变异位点。

图1 谷子SBD基因家族成员与其他物种直系同源蛋白系统进化树分析Fig.1 Phylogenetic tree analysis of SBD gene family in Setaria itialica and orthologous proteins in other species

2.4 谷子SBD基因家族成员启动子元件预测

启动子元件预测结果表明，除了基本启动子元件TATA-box和CAAT-box外，发现谷子淀粉结合域蛋白基因家族上游启动子序列包含一些与胁迫响应相关的顺式作用元件，如MYB转录因子结合元件，与内源激素IAA、ABA、ETH激素信号分子传导相关的元件，以及与厌氧、病原菌侵染、创伤等因素诱导的其他逆境胁迫相关的元件[12]。经调查分析，如表2所示：其中，SiSBD1基因上游启动子序列中包含最多的功能元件为33个光响应元件，其次为10个MeJA响应元件和5个MYB转录因子结合元件。SiSBD2基因上游启动子序列中包含最多的功能元件为36个光响应元件，其次为14个MeJA响应元件。SiSBD3基因上游启动子序列中包含最多的功能元件为27个光响应元件，其次为5个MYB转录因子结合元件。SiSBD4基因上游启动子序列中包含最多的功能元件为39个光响应元件，其次为8个MeJA响应元件。SiSBD5基因上游启动子序列中包含最多的功能元件为35个光响应元件，其次为8个MeJA响应元件。这些结果都暗示了谷子SBD基因家族成员的表达会强烈受到光诱导，而且受到MeJA激素信号分子的调控，从而间接响应干旱胁迫。

2.5 谷子SBD蛋白在干旱胁迫下的表达情况

PEG模拟干旱胁迫处理下，分析谷子SBD基因家族各成员在抗旱品种GG和干旱敏感品种JF-16相对表达量(图2)。结果表明：胁迫诱导下，谷子SBD1基因在GG品种中相对表达水平升高，达到89倍；但是该基因在JF-16品种中相对表达量差异不明显，暗示该基因在干旱条件下促进了淀粉的代谢，间接反映可溶性糖含量升高，从而提高抗逆性。另外3个成员，即SiSBD2、SiSBD4和SiSBD5基因，在GG和JF-16品种中相对表达量呈现降低趋势。而SiSBD3基因，在GG和JF-16品种中相对表达量均有上升的趋势，但差异不明显。结果暗示，干旱胁迫条件下，GAAase活性在抗旱品种GG增强导致环糊精和一些直链低聚糖积累，从而提高了谷子渗透调节能力，增强谷子干旱胁迫的耐受性。而PFKase活性在抗旱品种GG和干旱敏感品种JF-16的增强，暗示蔗糖同化物合成和光合作用的增加，导致谷子淀粉的积累，从而提高谷子耐逆性。其他成员PFKase2、AGTaes的活性降低，减缓了可溶性糖和淀粉的分解，从而间接增强了谷子干旱的耐受性。同时，以上结果也表明抗旱品种和干旱敏感性品种之间，该基因家族成员的功能多样性，在响应干旱胁迫过程中，为增强谷子干旱的耐逆性起到重要的作用。

表2 谷子SDB基因家族成员启动子元件功能预测

图2 谷子淀粉结合域蛋白基因家族响应PEG胁迫下相对表达量分析Fig.2 The relative expression level of SBD gene family under PEG stress in Setaria italica 注：A、B、C、D和E 分别表示SiSBD1、SiSBD2、SiSBD3、SiSBD4和SiSBD5基因相对表达水平。GG表示‘勾勾母鸡咀’品种；JF-16表示‘晋汾16’品种。Note: A, B, C, D and E indicated that SiSBD1、SiSBD2、SiSBD3、SiSBD4和SiSBD5 gene relative expression level, respectively. GG and JF-16 indicated two varieties with PEG and natural drought treatment

3 结论

植物在受到干旱胁迫时，细胞能够感知并传递干旱胁迫信号，激活特定转录调控因子诱导相关基因表达与调控，提高植物对干旱的适应和抗性[13]。谷子的抗旱性是其在水分胁迫条件下细胞在结构和生理生化上发生一系列适应性反应的结果，且受多基因控制，并遵循数量遗传规律，这就决定了谷子抗旱性反应的多样性。本实验以淀粉代谢关键酶SDB基因家族为研究对象，初步揭示了抗旱性强的品种比抗旱性弱的品种在遭受干旱胁迫时，SDB基因表达的增加，促进了淀粉的代谢，间接反映可溶性糖含量变化模式。这些研究结果将为我们进一步研究谷子如何通过调控淀粉代谢相关酶类的基因表达来提高其渗透调节和保水能力，为将来遗传改良谷子品种提供科学依据和理论基础。

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(编辑：武英耀)

Sequence characteristics and expression analysis ofSiSBDgene family in response to drought stress inSetariaitalica

Wang Jingrong1, Fu Rong1, Zhang Ze1, Li Hongying1,2,3*, Hou Siyu1,3

(1.CollegeofAgriculture,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,China; 2.KeyLabaratoryofCropGeneResourcesandGermplamEnhancementonLoessPlateau,MinistryofAgriculture,Taiyuan030031,China; 3.InstituteofAgriculturalBioengineering,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,China)

Foxtail millet is drought-tolerant crop, but the molecular mechanisms related to drought-tolerant are still unclear.[Objective]This study aimed to determine whether the drought-tolerant character of foxtail millet was related to the key enzymes of starch metabolism and lay the foundation for the further study on the molecular mechanism of drought resistance in foxtail millet and drought resistance breeding of foxtail millet.[Methods]Bioinformatics analysis was applied to analyze the basic sequence characteristics ofSBDgene family and the promoter elements in foxtail millet, built the phylogenetic tree of the gene family and determine the evolutionary relationships with other species. Based on digital gene expression profiling data, we analyzed the expression characteristics ofSiSBDgene in drought-tolerant variety ‘Gou Gou Mu Ji Ju (GG)’ and drought-sensitive variety ‘Jin Fen 16(JF-16)’ under PEG stress.[Results]The genome sequence data of foxtail millet showed that there were five members ofSiSBDgene family namedSiSBD1,SiSBD2,SiSBD3,SiSBD4 andSiSBD5. The sequence analysis indicated that the length of encoded protein sequence was in the range of 360～949 amino acid residues, the molecular weight was 39 ～ 108 KD, the isoelectric point was 4.18～6.72. TheCis-acting elements associated with drought tolerance were identified includingCis-acting elements related to MYB gene regulation, plant hormones as MEJA, ETH, SA, ABA, and plant defense and abiotic stress response regulation. The phylogenetic tree showed thatSiSBD1 andSBDinSorghumbicolorandZeamayswere classified to the same group;SiSBD2 andSBD2,SBD3 inZeamayswere classified to the same group;SiSBD3,SiSBD4 andSiSBD5 were classified to the same group. The analysis results of expression of starch binding domain gene family in foxtail millet under PEG stress showed that the expression ofSiSBD1 increased in drought-tolerant variety ‘Gou Gou Mu Ji Ju’ and decreased in drought -sensitive variety ‘Jin Fen 16’, the expression of other four genes decreased in both varieties.[Conclusion]These results suggested that theSDBgene families related with response to drought stress and laid a theoretical foundation for breeding drought tolerant variety in the future.

Setariaitalica, SBD gene family, CGTase, GAA, Drought resistance, Molecular mechanism

2016-10-28

2016-11-09

王晶蓉(1992- ) ， 女(汉)，山西闻喜人， 在读硕士，研究方向：杂粮基因工程

*通讯作者：李红英，教授，硕士生导师。Tel: 18636071589; E-mail: hongying1964@163.com

国家自然科学基金(31471556)

S515

A

1671-8151(2016)12-0855-05