单胺类及5-羟色胺拮抗剂对海湾扇贝幼虫生长的影响

马 斌,刘全圣,王 伟,赵 侠,赵玉明,王春德

( 青岛农业大学 海洋科学与工程学院，山东 青岛 266109 )

单胺类及5-羟色胺拮抗剂对海湾扇贝幼虫生长的影响

马 斌,刘全圣,王 伟,赵 侠,赵玉明,王春德

( 青岛农业大学 海洋科学与工程学院，山东 青岛 266109 )

单胺类药物左旋多巴胺和5-羟色胺一方面可能促进海湾扇贝幼虫纤毛活动从而促进幼虫摄食，另一方面引起纤毛运动强度的改变，又影响幼虫的能量消耗，因此对扇贝幼虫的生长可能存在着双重影响。以海湾扇贝幼虫为研究对象，探讨了左旋多巴胺和5-羟色胺及5-羟色胺的两种拮抗剂曲唑酮和赛庚啶对其生长的影响及其可能的作用机制。试验结果表明，0.1 ng/L左旋多巴胺和1.0 ng/L 5-羟色胺对海湾扇贝幼体的生长率促进作用最强，而5-羟色胺的促生长作用可被曲唑酮和赛庚啶抑制，说明5-羟色胺可能是通过5-HT1或5-HT2型受体起作用的。在海湾扇贝的育苗实践中可以选择使用低质量浓度的5-羟色胺以促进幼虫的生长。

海湾扇贝；幼虫生长；左旋多巴胺；5-羟色胺；曲唑酮；赛庚啶

我国北方的扇贝养殖业目前以引自美国的海湾扇贝(Argopectenirradiansirradians)为主[1]，产量和养殖面积占扇贝养殖的50%以上。海湾扇贝在23 ℃的水温中要经过10～11 d的浮游期生长才开始附着变态，成为稚贝。若能在此阶段加快幼虫的生长发育，缩短浮游期的时间，将可以有效降低培养过程中的死亡率，提高扇贝育苗的成功率。

5-羟色胺和多巴胺都是常见的单胺类神经递质，在动物中起到神经调节的作用。5-羟色胺和多巴胺也广泛存在于扇贝幼虫中，是扇贝神经系统早期发育中最早出现的神经递质之一，现有的报道主要集中于其参与幼虫附着变态的诱导[2-3]。实际上5-羟色胺和多巴胺还可能参与贝类的肌肉收缩、运动和摄食等行为，尤其是与纤毛运动有关的运动[4-7]。扇贝幼虫主要依靠具有大量纤毛的面盘进行运动和摄食行为，因此单胺类有可能通过对幼虫纤毛的控制而影响其运动和摄食，由于摄食和运动都有可能对幼虫的生长产生影响，因此有必要通过试验来确定单胺类药物对贝类幼虫生长的效应。

本试验以海湾扇贝幼虫为研究对象，研究不同质量浓度5-羟色胺和左旋多巴胺对幼虫生长的影响；通过研究5-羟色胺拮抗剂曲唑酮和赛庚啶对5-羟色胺作用的抑制，研究5-羟色胺可能的作用机制，为海湾扇贝的幼虫生长调节提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用海湾扇贝为胶南海丰盛福育苗场培育的经过室内催熟的1龄亲贝，单独刺激产卵分别获得不同亲贝的精卵若干，分组混合受精。在23 ℃下孵化22 h后选优，取上层浮游能力强的幼虫用于本试验。试验用试剂左旋多巴胺、5-羟色胺、赛庚啶和曲唑酮等均购自美国Sigma公司。

1.2 试验方法

1.2.1 左旋多巴胺对海湾扇贝幼虫生长的影响

试验容器为2000 mL的烧杯，试验水体为1600 mL，通过水浴控制水温23.5 ℃，试验选择同一批次的刚刚孵出的1日龄扇贝幼虫平均初始壳高为(88.7±0.6) μm，设定密度为1个/mL。根据预备试验的结果，分别加入左旋多巴胺母液使试验容器的最终质量浓度为10.0、1.0、0.1 ng/L，对照组不添加左旋多巴胺。每隔4 h投喂一次密度为2.0×106个/mL的球等鞭金藻(Isochrysisgalbana)(3011) 10 mL，每隔24 h用300目筛绢全量换水一次并补充左旋多巴胺母液以保持相同的幼虫密度和药物质量浓度。每个试验组和对照组均设置3组重复。试验持续72 h，在试验开始和结束时分别测量30个幼虫的壳高和壳长，计算幼虫在试验阶段的生长速度。

1.2.2 5-羟色胺对海湾扇贝幼虫生长的影响

选择同一批次的刚刚孵化出的扇贝幼虫，幼虫的平均初始壳高为(89.3±0.7) μm，分别加到2000 mL的烧杯中，加入5-羟色胺母液，加23 ℃海水定容到1600 mL，使幼虫的密度达到1个/mL，根据预备试验的结果，5-羟色胺的最终质量浓度分别设定为50、10、1.0 ng/L和0.1 ng/L，对照组不添加5-羟色胺。每隔4 h投喂一次密度为2.0×106个/mL的球等鞭金藻(3011) 10 mL，每隔24 h用300目筛绢全量换水一次并补充5-羟色胺母液以保持相同的幼虫密度和药物质量浓度。每个试验组和对照组均设置3组重复。试验持续72 h，在试验开始和结束时分别测量30个幼虫的壳高和壳长，计算幼虫在试验阶段的生长速度。

1.2.3 5-羟色胺拮抗剂对5-羟色胺促生长作用的影响

根据上述的试验结果，选择促进生长作用最强的5-羟色胺质量浓度，在施加五羟色胺的同时分别施加0.1、1.0、10 ng/L的曲唑酮或赛庚啶，药物处理时间为72 h，每隔24 h换水一次，同时补药。幼虫密度和饵料投放密度及时间同上。对照组只施加最强质量浓度的5-羟色胺或不添加任何药物(空白对照)，每组设置3个重复试验。在试验开始和结束时分别测量30个幼虫的壳高和壳长，计算幼虫在试验阶段的生长速度。

1.3 试验数据及处理

根据每组的初始和试验结束时的平均壳高或壳长计算平均生长速度，以平均值±标准差来表示。相关数据用SPSS 19.0软件处理，不同试验组之间采用单因素方差方法分析，若差异显著则采用Duncan检验进行多重比较，差异显著性设置为P<0.05。

2 结 果

2.1 左旋多巴胺对海湾扇贝幼虫生长的影响

试验观察到施加高质量浓度的左旋多巴胺幼虫活跃程度下降，纤毛的摆动频率降低，幼虫游泳速度也减缓。试验结果表明，左旋多巴胺显著影响海湾扇贝幼虫的生长(表1)。在10.0 ng/L和1.0 ng/L质量浓度的试验组中海湾扇贝幼虫的壳长和壳高生长率均显著小于空白对照组(P<0.05)，说明高质量浓度的左旋多巴胺对扇贝幼虫的生长发育有一定的抑制作用，导致扇贝幼虫的生长发育缓慢。当左旋多巴胺的质量浓度降低到0.1 ng/L时，试验组扇贝幼虫的壳长和壳高生长率与空白对照组无显著差异(P>0.05)，说明0.1 ng/L质量浓度的左旋多巴胺对扇贝幼虫的生长发育没有影响。

表1 左旋多巴胺对海湾扇贝幼虫的生长影响

注：同一列参数的上标不同表示差异显著(P<0.05), n=3. 其他表同.

2.2 5-羟色胺对海湾扇贝幼虫生长的影响

试验观察到施加5-羟色胺组幼虫表现极度活跃，纤毛的摆动频率和游泳速度均显著加强。试验结果显示，5-羟色胺对扇贝幼虫的生长表现为剂量依赖效应，高质量浓度时(50 ng/L和10 ng/L)抑制海湾扇贝幼虫的生长，1.0 ng/L的5-羟色胺对壳高和壳长具有显著的促进作用，而当质量浓度降至0.1 ng/L时5-羟色胺对其生长无显著影响(P>0.05)，与空白对照相比差异不显著(P>0.05)(表2)。

表2 5-羟色胺对海湾扇贝幼虫生长的影响

2.3 5-羟色胺拮抗剂对海湾扇贝幼虫生长作用的影响

单独施加1.0 ng/L 赛庚啶或与1.0 ng/L 5-羟色胺联合施用时幼虫的纤毛摆动频率无显著变化(P>0.05)，但当加入高质量浓度的赛庚啶时，幼虫的纤毛运动表现异常，表现为摆动频率下降且运动方向不规律。试验结果表明，单独施用赛庚啶处理对海湾扇贝幼虫壳长和壳高的生长无显著影响(P>0.05),而单独施用5-羟色胺(1.0 ng/L)显著促进扇贝幼虫壳高和壳长的生长(表3)。5-羟色胺拮抗剂赛庚啶在低质量浓度(0.1～1.0 ng/L)时显著抑制5-羟色胺对幼虫壳高和壳长的促生长作用，而质量浓度进一步提高到10 ng/L时则对幼虫的生长具有强烈的抑制作用，幼虫的生长几乎停止。

表3 赛庚啶对5-羟色胺促生长作用的影响

注：C为赛庚啶.

单独施加曲唑酮或与1.0 ng/L的5-羟色胺联合施用时幼虫的纤毛运动没有显著变化(P>0.05)。曲唑酮对生长的影响结果见表4。与空白对照组相比，用5-羟色胺(1.0 ng/L)处理的试验组显著促进扇贝幼虫的生长，而用曲唑酮单独处理对海湾扇贝幼虫壳长和壳高生长无明显的抑制作用。当将曲唑酮与1.0 ng/L的5-羟色胺共同施用时，随着曲唑酮质量浓度的提高，5-羟色胺的促生长作用逐渐被抑制。

表4 曲唑酮对5-羟色胺促生长作用的影响

注：T为曲唑酮.

3 讨 论

多巴胺和5-羟色胺是广泛分布于双壳贝类中的单胺类神经递质[8]。Kreiling 等[7]发现在硬壳蛤的早期发育中，多巴胺和5-羟色胺等神经元在受精后24 h内即已出现，多巴胺受体D2也在幼虫孵化前出现。Cann-Moisan等[4]发现，在欧洲大扇贝(Pectenmaximus)幼虫中多巴胺和5-羟色胺的含量随着发育阶段而升高，在附着前达到高峰。在双壳贝类中，多巴胺能和5-羟色胺能神经元主要分布于口球神经节、脑神经节和足神经节[9]，可能参与扇贝幼虫变态调控过程[2]。在无脊椎动物如贝类和棘皮动物中，多巴胺和5-羟色胺广泛存在于控制幼虫纤毛的神经元中，并控制纤毛的运动，从而控制幼虫依靠纤毛运动的行为[5,10]。Carroll等[5]也证明美洲牡蛎(Crassostreavirginica)的纤毛运动由多巴胺能和5-羟色胺能神经元控制，5-羟色胺药浴能够显著提高纤毛的摆动速度并可以被5-羟色胺拮抗剂甲基麦角酸胺所抑制，而多巴胺药浴则可显著降低纤毛的摆动速度并可被多巴胺拮抗剂ergonovine 所抑制。单胺类可能是通过控制细胞中钙离子和环磷酸腺苷的释放而控制纤毛的运动[11]。贝类幼虫的摄食行为依赖于纤毛的运动，幼虫依靠面盘纤毛的摆动形成水流从而摄入单细胞藻类，因此纤毛运动速度的增加往往意味着更多的饵料摄入，从而促进幼虫的生长。另一方面，纤毛的运动需要消耗额外的能量，因而将有可能抑制幼虫的生长。两种作用相互平衡的结果将决定该药物对扇贝幼虫的净作用。多巴胺和5-羟色胺均对贝类的滤水率有显著影响[12]，因而也对扇贝幼虫的壳长净增长产生影响。

3.1 左旋多巴胺对扇贝幼虫生长的影响

本试验结果表明，1.0～10 ng/L的左旋多巴胺显著抑制扇贝幼虫的生长，而且这种作用只有在质量浓度降低到0.1 ng/L时才消失。在试验中还观察到，施加多巴胺可降低幼虫纤毛的运动速度。Smith[8]曾报道，在贻贝(Mytiluscalifornianus)中，多巴胺通常通过与神经元细胞膜上的受体结合而传递神经信号从而控制纤毛的运动。而多巴胺对纤毛的抑制作用有可能是由其对幼虫的多巴胺能神经元的毒性造成的,类似的作用已在斑马鱼(Daniorerio)幼鱼中报道过[13]。因此，多巴胺对扇贝幼虫生长的抑制作用可能是通过对纤毛活动的抑制而引起的，多巴胺可能通过降低纤毛的运动速度或频率，来降低幼虫的摄食活动，从而抑制幼虫的生长。

3.2 5-羟色胺对扇贝幼虫生长的影响

试验结果显示高质量浓度(>10 ng/L)的5-羟色胺对扇贝幼虫的生长有明显的抑制作用，1.0 ng/L的5-羟色胺对于海湾扇贝幼体生长率有明显的促进作用，这种促进作用随着5-羟色胺质量浓度的降低而消失。同时，试验观察到，随着5-羟色胺质量浓度的提高，扇贝纤毛的摆动频率显著提高。基于上述结果分析，有可能在高质量浓度时，5-羟色胺通过促进纤毛的摆动而促进幼虫的摄食作用从而提高幼虫的生长，但是由于纤毛的过速运动消耗额外的能量，摄食增加对生长的促进作用不足以补偿消耗的能量，因此幼虫的生长受到抑制。在适宜的5-羟色胺(1.0 ng/L)质量浓度下，由于摄食提高而对生长的促进作用大于纤毛运动增加所消耗的额外能量，因此幼虫生长得到提高。而在0.1 ng/L的5-羟色胺质量浓度下，这两种作用可能相互抵消，因而对扇贝幼虫的生长影响不显著。类似的结果在罗氏沼虾(Macrobrachiumrosenbergii)中也曾有报道，Chettria等[14]发现，用100 μg/mL的5-羟色胺药浴2 d，显著提高罗氏沼虾幼虾的生长、存活和色素形成, 而在饲料中添加5-羟色胺的效果则稍差。

在高等动物中，迄今已发现了5-羟色胺受体的7种类型13个亚型(5-HT1A、5-HT1B、5-HT1D、5-HT1F、5-HT2A、5-HT2B、5-HT2C、5-HT3、5-HT4、5-HT5A、5-HT5B、5-HT6、5-HT7)[15]。5-羟色胺受体也广泛存在于无脊椎动物中, 并已在贝类中被发现[16-18]。Wang等[17]在合浦珠母贝(Pinctadafucata)中克隆到一个类似于5-HT1型的受体，而虾夷扇贝(Patinopectenyessoensis)中的5-羟色胺受体兼具5-HT1和5-HT2的特点[18]。为初步确定海湾扇贝幼虫中可能的5-羟色胺受体类型，本试验选择了曲唑酮和赛庚啶两种5-羟色胺拮抗剂来研究其对5-羟色胺的促生长作用的影响。曲唑酮是一种5-羟色胺选择性抑制剂，主要对5-HT2受体产生拮抗作用，是一种5-HT2A拮抗剂[19-20]。赛庚啶是一种哌啶化合物,具有广泛的药理应用，该药是一种非选择性的 5-羟色胺受体阻断剂,对5-HT1和5-HT2受体都有阻断作用[21]。通过5-羟色胺两种拮抗剂对5-羟色胺促扇贝苗生长作用的影响可以推测出5-羟色胺在其体内的受体种类。本研究的结果表明，赛庚啶对5-羟色胺诱导的促幼虫生长作用有显著的抑制作用，质量浓度越高抑制作用越明显，证明海湾扇贝体内可能存在可被赛庚啶阻断的5-HT1或5-HT2受体(或者这两种受体的某种亚型)。而曲唑酮对5-羟色胺诱导的幼虫促生长作用没有显著的抑制作用，说明海湾扇贝幼虫体内可能不存在5-HT2A型受体。

本研究的结果证明，适宜质量浓度的5-羟色胺可以显著提高海湾扇贝幼虫生长率，因此在生产实践中可以选择使用5-羟色胺来有效减少海湾扇贝浮游幼虫培育时间，提高生产效率。

[1] 张福绥,何义朝,刘祥生,等.海湾扇贝(Argopectenirradians)引种、育苗及试养[J].海洋与湖沼，1986, 7(5):367-374.

[2] 张涛，阙华勇，杨红生,等. 海湾扇贝幼虫变态过程中体内神经递质含量的变化[J]. 海洋与湖沼，2002，33(5)：239-244.

[3] Grant M N, Meritt D W, Kimmel D G. Chemical induction of settlement behavior in larvae of the eastern oysterCrassostreavirginica(Gmelin) [J]. Aquaculture, 2013(402/403):84-91.

[4] Cann-Moisan C, Nicolas L, Robert R. Ontogenic changes in the contents of dopamine, norepinephrine and serotonin in larvae and postlarvae of the bivalvePectenmaximus[J]. Aquatic Living Resources, 2002, 15(5):313-318.

[5] Carroll M A, Catapane E J. The nervous system control of lateral ciliary activity of the gill of the bivalve mollusc,Crassostreavirginica[J] . Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology, 2007, 148(2)：445-450.

[6] Filla A, Hiripi L, Elekes K. Role of aminergic (serotonin and dopamine) systems in the embryogenesis and different embryonic behaviors of the pond snail,Lymnaeastagnalis[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology, 2009, 149(1):73-82.

[7] Kreiling J A, Jessen-Eller K, Miller J, et al. Early development of the serotonergic and dopaminergic nervous system inSpisulasolidissima(surf clam) larvae [J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology, 2001, 130(2):341-351.

[8] Smith J R. A survey of endogenous dopamine and serotonin in ciliated and nervous tissues of five species of marine bivalves, with evidence for specific, high-affinity dopamine receptors in ciliated tissue ofMytiluscalifornianus[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Comparative Pharmacology, 1982, 71(1):57-61.

[9] 孙虎山, 王宜艳. 栉孔扇贝神经节结构的显微观察[J]. 中国水产科学, 2007，14(3)：390-396.

[10] Yoshihiro M, Keiko W, Chieko O, et al. Regulation of ciliary movement in sea urchin embryos: dopamine and 5-HT change the swimming behavior [J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Comparative Pharmacology, 1992, 101(2):251-254.

[11] Gentleman S,Mansour T E. Control of Ca2+efflux and cyclic AMP by 5-hydroxytryptamine and dopamine in abalone gill [J]. Life Sciences, 1977, 20(4):687-694.

[12] JonesH D, Richards O G. The effects of acetylcholine, dopamine and 5-hydroxytryptamine on water pumping rate and pressure in the musselMytilusedulisL [J]. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology, 1993, 170(2):227-240.

[13] Stednitza S J, Freshnera B, Sheltona S, et al. Selective toxicity of L-DOPA to dopamine transporter-expressing neurons and locomotor behavior in zebrafish larvae [J]. Neurotoxicology and Teratology, 2015, 52(Pt A):51-56.

[14] Chettria J K, Sahub N P, Palb A K, et al. Comparative performance of gamma amino butyric acid (GABA) and 5-hydroxytryptamine (5-HT) in the diet of larvae and post larvae of giant freshwater prawn,Macrobrachiumrosenbergii: effect of dose and route of administration on growth and survival [J]. Aquaculture, 2007, 270(1/4): 240-248.

[15] 辛洪波，邓柯玉. 5-羟色胺受体的分型、分布和功能[J]. 生理科学进展，1990，21(3)：235-241.

[16] Tierney A J. Structure and function of invertebrate 5-HT receptors: a review [J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology, 2001, 128(4):791-804.

[17] Wang Q, He M. Molecular characterization and analysis of a putative 5-HT receptor involved in reproduction process of the pearl oysterPinctadafucata[J]. General and Comparative Endocrinology, 2014(204):71-79.

[18] Tanabe T, Yuan Y, Nakamura S. The role in spawning of a putative serotonin receptor isolated from the germ and ciliary cells of the gonoduct in the gonad of the Japanese scallop,Patinopectenyessoensis[J]. General and Comparative Endocrinology, 2010, 166(3):620-627.

[19] McMillen B A, Walter S, Wiliams H L, et al. Comparison of the action of the 5-HT2antagonists amperozide and trazodone on preference for alcohol in rats [J]. Alcohol, 1994, 11(3)：203-206.

[20] Luttinger D, Freedman M, Hamel L， et al. The effects of serotonin antagonists in a behavioral despair procedure in mice [J]. European Journal of Pharmacology, 1984, 107(1):53-58.

[21] 王春玉，李麟仙. 大脑5-HT的变化及5-HT2受体拮抗剂赛庚啶对沙土鼠脑缺血的影响[J]. 中国病理生理杂志，1995，11(3)：296-300.

EffectsofMonoaminesand5-HTAntagonistsonLarvalGrowthinBayScallop

MA Bin, LIU Quansheng, WANG Wei, ZHAO Xia, ZHAO Yuming, WANG Chunde

( College of Marine Science and Engineering, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109，China )

L-dopamine and serotonin (5-HT) are routine monoamine neurotransmitters that may have dual effects on the larval growth of the bay scallopArgopectenirradiansirradians. They may accelerate larval growth by stimulating cilia beating and thus feeding while inhibition of larval growth may occur as a result of extra energy cost caused by accelerated ciliary movements. This study aimed to determine the ultimate outcome of the dual effects of L-dopamine and 5-HT on larval growth and also explore the underlying mechanism by examining the actions of 5-HT and its antagonists, trazodone and cyproheptadine. The results showed that larval growth was most accelerated by 0.1 ng/L L-dopamine and 1.0 ng/L 5-HT. The blockade of the 5-HT actions by its antagonists suggests that 5-HT may exert its effects via its binding to 5-HT2A receptor. These monoamines may be potentially used to accelerate larval growth in scallop culture.

bay scallop; larval growth; L-dopamine; serotonin (5-HT); trazodone; cyproheptadine

10.16378/j.cnki.1003-1111.2016.06.003

S968.313

A

1003-1111(2016)06-0620-05

2016-03-21；

2016-05-11.

国家自然科学基金面上项目(31572168)；山东省农业重大应用技术创新项目；山东省现代农业产业技术体系贝类创新团队建设项目.

马斌(1987—)，男，硕士研究生；研究方向：贝类遗传育种学. E-mail：hereiammabin@163.com.通讯作者：王春德(1967—)，男，教授；研究方向：海洋生物遗传育种.E-mail：chundewang2007@163.com.