脱毒菜籽多肽对大鼠的亚慢性毒性研究

杨 雪， 李云亮， 王禹程， 黄姗芬， 马海乐

(江苏大学食品与生物工程学院， 江苏镇江 212013)

Note:* stands for significant difference compared with male rats in control group(P<0.05); ** stands for extremely significant difference compared with male rats in control group(P<0.05).

Note:** stands for extremely significant difference compared with male rats in control group(P<0.05).

Note:* stands for significant difference compared with female rats in control group(P<0.05).

Note: * stands for significant difference compared with rats with the same sex in control group(P<0.05); ** stands for extremely significant difference compared with rats with the same sex in control group(P<0.01).

Note:* stands for significant difference compared with rats with the same sex in control group(P<0.05); ** stands for extremely significant difference compared with rats with the same sex in control group(P<0.05).



脱毒菜籽多肽对大鼠的亚慢性毒性研究

杨 雪， 李云亮， 王禹程， 黄姗芬， 马海乐*

(江苏大学食品与生物工程学院， 江苏镇江 212013)

[目的]通过对大鼠的90 d喂养试验，评价脱毒菜籽多肽的食用安全性。[方法]将动物随机分为4组，分别为低、中、高剂量组和对照组。试验组分别在基础饲料中添加1.65、3.30和6.60 g/kg脱毒菜籽多肽，按80 g/kg的日摄入量以自由采食的方式喂养大鼠90 d，观察脱毒菜籽多肽对大鼠体重、进食量、食物利用率、血清学、脏器系数以及组织病理学等指标的影响。[结果]与对照组相比，各剂量组大鼠体重、进食量、食物利用率、脏器绝对重量和脏体比均无显著差异(P>0.05)，大鼠血液学指标检测值、生化指标检测值均在正常范围内；高剂量组各大鼠脏器均未出现明显的组织病理变化。[结论]脱毒菜籽多肽对大鼠的生长发育、血浆、生化功能及脏体比等指标均未见不良影响。

脱毒菜籽多肽；喂养试验；组织学检查；血液学指标；血清生化指标

我国是菜籽粕生产第一大国，每年可产800万t以上[1]，且价格较低，期货价格在2 500元/t上下波动。菜籽蛋白占菜籽饼粕的30%以上，为全价蛋白质，且其营养价值与大豆蛋白和酪蛋白相接近[2-3]，含有丰富的人体必需氨基酸，是一种理想的、潜在的优质蛋白资源，具有较高的开发利用价值[4-5]，精深加工菜籽蛋白已成为充分利用优质蛋白质的新热点。

由于菜籽饼粕中的一些有毒成分和抗营养成分的存在，包括硫甙及其代谢衍生物、植酸、单宁和芥子碱等，影响了其蛋白质的消化吸收及利用。因此，菜籽饼粕只能在饲料中少量添加或脱毒后使用。常见的脱毒方法包括物理脱毒法、化学脱毒法和生物脱毒法，其中化学脱毒方法脱毒较为彻底。兰文菊等[6]研究表明使用硫酸溶液脱毒后菜籽粕中植酸、单宁、硫代葡萄糖苷、异硫氰酸酯和噁唑烷硫酮的脱除率均高于90%，且蛋白质含量升高、氨基酸组成基本维持不变。因此，采用酸浸溶法脱毒后的菜籽蛋白，再经过碱溶酸沉的方法提取蛋白后可获得优质的脱毒菜籽蛋白，目前许多研究者基于脱毒菜籽蛋白制备了具有多种生物学功能的多肽[7]。

多肽是比蛋白质结构更简单、分子量小、由氨基酸通过肽链相连的一类化合物，具有调节机体生理功能和为机体提供营养的双重功效，它几乎影响着人体的所有代谢合成[8]。研究表明，某些多肽不仅能提供人体生长发育所需的营养物质，而且具有防病治病、调节人体生理机能的功效，具有一些原食品蛋白质或其组成氨基酸所不具备的独特的生物活性[9-10]。利用酶解或水解法制备菜籽多肽是开发与利用菜籽蛋白资源的重要途径之一[11-12]。然而，长期食用脱毒后的菜籽多肽是否会对机体产生毒副作用还有待进一步探索。笔者通过大鼠的90 d喂养试验，研究了脱毒菜籽多肽对动物机体的亚慢性毒性，旨在为脱毒菜籽多肽作为保健食品进行开发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 脱毒菜籽多肽。脱毒菜籽多肽购自江苏天琦生物科技有限公司，多肽含量≥85%。

1.1.2 主要仪器和试剂。生化试剂盒；自动生化分析仪、血细胞分析仪、病理切片机、离心机等。

1.1.3 实验动物。4周龄健康SD大鼠，雌雄各48只，共90只，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，清洁级，动物生产许可证号为SCXK(沪)2012-0002号。实验动物屏障环境设施的使用许可证号为SYXK(苏)2012-0037号，雌雄大鼠进室适应3 d后分性别按体重分成4组，每组12只，均单笼饲养，无菌水自由饮用。

1.2 试验方法

1.2.1 动物分组及受试物剂量。脱毒菜籽多肽推荐剂量为22.00 mg/kg，设置高剂量组(6.6 g/kg)以及中剂量组(3.30 g/kg)和低剂量组(1.65 g/kg)。分别称取82.500、41.250和20.625 g脱毒菜籽多肽拌入灭菌基础鼠饲料(购自苏州双狮实验动物饲料科技有限公司，合格证号为苏饲审(2009)05032号)，按80 g/kg 的日摄入量给予大鼠自由食用，饲养90 d。

1.2.2 生长发育情况观察。每天观察大鼠的排便、进食及活动等情况2次，视纳食情况调整喂食量，每7 d称1次体重和2次食物摄入量，计算每周及总的食物利用率及实际平均每天摄入受试物的剂量。

1.2.3 样本采取及测定指标。饲养中期对大鼠内呲静脉采血，测其血红蛋白、血小板、红细胞、白细胞总数及分类，结束时取血，进行大体解剖检查，取脏器称重，固定并保存。对大鼠血红蛋白、血小板、红细胞、白细胞总数及分类、脑、心脏、肝、脾、肺、肾、肾上腺、胸腺、睾丸、卵巢绝对重量和脏体比、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、血糖(GLU)、尿素氮(BUN)、肌酐(CRE)、总胆固醇(CHO)、甘油三酯(TG)进行测定，90 d喂养试验结束后对大鼠进行大体解剖，并对其脑、心脏、肝、脾、肺、肾、肾上腺、胸腺、胃、十二指肠、睾丸、卵巢、子宫进行组织切片病理学检查。

1.3 数据统计与分析 各项测定指标均使用SPSS 16.0统计软件进行单因素方差分析，方差不齐先进行变量转换，仍不齐改用秩和检验分析。

2 结果与分析

2.1 大鼠的生长发育 90 d喂养期间，各组大鼠生长发育良好，皮毛浓密有光泽，饮食、行为、精神状态等未见异常，试验期间无1例动物死亡。

2.2 脱毒菜籽多肽对大鼠体重的影响 试验开始前测定大鼠始重，并于试验开始后测定每周大鼠的体重。由表1可知，各剂量组雌雄不同时间大鼠的体重与对照组相比均无显著差异(P>0.05)。这说明不同用量的脱毒菜籽多肽对雄性和雌性大鼠均无毒性。

表1 脱毒菜籽多肽对大鼠体重的影响

2.3 脱毒菜籽多肽对大鼠进食量和食物利用率的影响 由表2和表3可知，43～49 d因喂养过程中期对大鼠内眦静脉采血测定血液学指标，导致试验组与对照组雌雄大鼠的食物利用率均出现下降现象。此外，其他组雌雄大鼠每周进食量及总进食量、每周食物利用率及总食物利用率与对照组相比均无显著差异(P>0.05)。

表2 脱毒菜籽多肽对大鼠每周进食量和总进食量的影响

2.4 脱毒菜籽多肽对大鼠血细胞计数和白细胞分类的影响 分别于试验中期和末期，通过对大鼠内呲静脉采血测定血红蛋白、血小板、红细胞、白细胞总数及分类。由表4和表5可知，喂养中期低剂量组、高剂量组雄性大鼠HGB降低，喂养末期高剂量组雄性大鼠的血小板计数(PLT)升高，与对照组相比差异显著(P<0.01)，但数值均在正常范围内[13-14]，且无剂量-反应关系，故不认为具有生物学意义。其他剂量组各指标与对照组相比，均无显著差异(P>0.05)。

由表6和表7可知，喂养中期、喂养末期雌雄大鼠白细胞分类的有些指标与对照值相比差异有显著性(P<0.05,P<0.01)，但数值均在正常值范围内[13-14]，且无剂量-反应关系，故不认为具有生物学意义。其他剂量组各指标与对照组相比，均无显著差异(P>0.05)。

表3 脱毒菜籽多肽对大鼠食物利用率的影响

表4 脱毒菜籽多肽对喂养中期大鼠血细胞计数的影响

注：*表示与对照组雄性大鼠相比差异显著(P<0.05)；**表示与对照组雄性大鼠差异极显著(P<0.01)。

Note:*stands for significant difference compared with male rats in control group(P<0.05);**stands for extremely significant difference compared with male rats in control group(P<0.05).

表5 脱毒菜籽多肽对喂养末期大鼠血细胞计数的影响

注：**表示与对照组雄性大鼠差异极显著(P<0.05)。

Note:**stands for extremely significant difference compared with male rats in control group(P<0.05).

%

注：*表示与对照组雌性大鼠差异显著(P<0.05)。

Note:*stands for significant difference compared with female rats in control group(P<0.05).

2.5 脱毒菜籽多肽对大鼠血清生化指标的影响 试验结束后采血，测定大鼠的血清生化指标。由表8可知，与对照组相比，低剂量组雌性大鼠的血糖(GLU)升高，低、中剂量组雄性大鼠的总蛋白(TP)降低，低剂量组雄性大鼠的白蛋白(ALB)降低，差异均达到显著水平(P<0.05,P<0.01)，但数值均在正常范围内[13-14]，且无剂量-反应关系，故不认为具有生物学意义。其他剂量组雌雄大鼠的生化指标与对照组相比均无显著差异(P>0.05)。

%

注：*表示与相同性别对照组大鼠差异显著(P<0.05)；**表示与相同性别对照组大鼠差异极显著(P<0.01)。

Note:*stands for significant difference compared with rats with the same sex in control group(P<0.05);**stands for extremely significant difference compared with rats with the same sex in control group(P<0.01).

表8 脱毒菜籽多肽对大鼠血清生化指标的影响

注：*表示与相同性别对照组大鼠差异显著(P<0.05)；**表示与相同性别对照组大鼠差异极显著(P<0.05)。

Note:*stands for significant difference compared with rats with the same sex in control group(P<0.05);**stands for extremely significant difference compared with rats with the same sex in control group(P<0.05).

2.6 脱毒菜籽多肽对大鼠脏器绝对重量和脏器比的影响 试验结束后，对大鼠进行大体解剖检查，取脏器称重，固定、保存，分别测定大鼠脏器绝对重量和脏器比。由表9和表10可知，各剂量组雌雄大鼠脏器绝对重量、脏体比与对照组相比均无显著差异(P>0.05)。

表9 脱毒菜籽多肽对大鼠脏器绝对重量的影响

%

2.7 大体解剖和组织学检查 对大鼠进行大体解剖，对照组出现1例雄鼠局部肝细胞轻度脂肪变性、1例雌鼠肺左叶局部血管轻度充血，局部间质炎细胞浸润、1例雄鼠肾上腺皮质区束状带细胞轻度空泡变性。高剂量组出现1例雄鼠局部心肌炎细胞浸润、1例雄鼠局部肝细胞轻度脂肪变性、雌鼠1例肺左叶局部间质轻度炎细胞浸润，雌鼠1例左肺局部间质血管轻度出血。此外，对照组和高剂量组大鼠的大脑、小脑、脾脏、肾、胸腺、胃、十二指肠、卵巢、子宫睾丸均未见明显异常。

2.8 各试验组大鼠实际摄入受试物剂量 通过90 d喂养试验结束后，计算大鼠平均每天受试物的摄入量。由表11可知，雌性大鼠平均每天受试物的摄入量略高于设定的剂量，而雄性大鼠则略有降低。

表11 大鼠实际摄入脱毒菜籽多肽剂量

3 讨论与结论

大量研究表明，菜籽多肽具有多种生物学活性，除了降血压[15-17]、清除体内自由基、具有抗氧化作用[18-19]外，菜籽多肽还具有醒酒[20]、抗凝血[21]、抗肿瘤和增强免疫力[22]等功能。经过脱毒后的菜籽蛋白是一种非常好的资源，长期服用菜籽多肽是否具有毒性尚未确定。为探讨脱毒菜籽多肽长期服用的安全性，笔者通过90天喂养试验对脱毒菜籽多肽的亚慢性毒性进行了研究，观察了受试物以不同剂量水平经长期喂养后对动物的毒性作用性质和靶器官，并初步确定最大无毒副作用剂量。该试验结果表明，试验期内各剂量组大鼠生长发育良好，体重增重、食物利用率、血常规、血生化、脏器系数等各项指标均在正常值范围内，与对照组之间差异均无统计学意义,经病理组织学检查，各剂量组也未发现受试物质造成的病理学改变和损伤。

该试验结果表明，脱毒菜籽多肽对大鼠90 d喂养试验各项指标均未见明显毒性反应,最大无作用剂量为6.6 g/kg,已达到人体推荐每日摄入量的300倍。在该试验条件下长期服用脱毒菜籽多肽对机体并无明显不良反应，但由于实验动物种类的局限性和试验时间的限制，对脱毒菜籽多肽食用安全性的评价还需要进行更加深入和长期的试验研究。参考文献

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Study on Subchronic Toxicity of Detoxification Rapeseed Peptide on Rats

YANG Xue,LI Yun-liang,WANG Yu-cheng,MA Hai-le*et al

(School of Food and Biological Engineering,Jiangsu University,Zhenjiang,Jiangsu 212013)

[Objective] To access sinchronic toxicity of detoxification rapeseed peptides,ninty days feeding study of rats were researched.[Method] Experimental animals were divided into four groups,including low-dosage,middle-dosage and high-dosage group and control group.According to the daily free feed intake of 80 g/kg, basic feed in experimental group were added with 1.65,3.30,6.60 g/kg dose detoxification rapeseed peptides respectively,for 90 days to observe effects of detoxification rapeseed peptides on rat weight,feed intake,food utilization rate,serology indexes,organ coefficient and tissue pathology.[Result]Compared with control group,there were no significant difference (P>0.05) of weight,feed intake,food utilization rate,absolute visceral organ weight and organ/body weight ratio in each dosage group,and hematology and biochemical index of rats were within normal range; In high-dosage group,there was no obviously histopathologic change of rat visceral organ.[Conclusion] Detoxification rapeseed peptides had no adverse effects on the growth and development,plasma,biological function,organ/body weight ratio of rats.

Detoxification rapeseed peptide;Feeding test;Histological examination; Hematology index; Blood biochemical index

国家高技术研究发展计划项目(2013AA102203)；江苏大学高级人才科研启动基金项目(16JDG049)。

杨雪(1989- )，女，河北承德人，博士研究生，研究方向：多肽提取与功能评价。*通讯作者，教授，博士生导师，从事功能食品、食品物理学加工方法及装备开发研究。

2016-08-31

S 865.1

A

0517-6611(2016)33-0148-05