基于ITS序列鉴别真菌类药材马勃及其混伪品

张嘉丽 黄宇航 宋 明 任阳阳 张梦婷 刘 霞 孙 伟 陈士林

(1 武汉理工大学化学化工与生命科学学院,武汉，430070； 2 安利(中国)植物研发中心，无锡，214145；3 中国中医科学院中药研究所，北京，100700)



基于ITS序列鉴别真菌类药材马勃及其混伪品

张嘉丽1,3黄宇航1宋 明2任阳阳1张梦婷1刘 霞1孙 伟3陈士林1,3

(1 武汉理工大学化学化工与生命科学学院,武汉，430070； 2 安利(中国)植物研发中心，无锡，214145；3 中国中医科学院中药研究所，北京，100700)

目的:运用ITS序列鉴别真菌类药材马勃Lasiosphaeracalvatia及其混伪品。方法：收集来自重庆、北京等9个地方的21份脱皮马勃、大马勃、紫色马勃样品，提取基因组DNA，经PCR扩增后双向测序。同时从GenBank上下载常见马勃药材混伪品的序列。将所有序列进行剪切校准拼接后分析，基于K2P(Kimura 2-Parameter)模型计算马勃及其混伪品的种内和种间遗传距离，并构建Neighbor-Joining(NJ)系统聚类树。结果：大马勃的ITS序列种内最大K2P遗传距离为0；脱皮马勃的ITS序列种内最大K2P遗传距离为0.003；紫色马勃的ITS序列种内最大遗传距离为0.003。大马勃与混伪品种间最小K2P遗传距离为0.019，脱皮马勃与混伪品种间最小K2P遗传距离为0.031，紫色马勃与混伪品种间最小K2P遗传距离为0.634。大马勃、脱皮马勃、紫色马勃的种内最大遗传距离均小于它们与混伪品的种间最小遗传距离。NJ树结果显示大马勃、紫色马勃、脱皮马勃各自聚为一支，表现出良好的单系性，能够与混伪品明显的区别开来。结论：基于ITS序列的条形码技术可以将马勃药材及其混伪品有效进行鉴别。

马勃；混伪品；ITS；条形码

马勃Lasiosphaeracalvatia为灰包科真菌脱皮马勃LasiosphaerafenzliiReich.、大马勃Calvatiagigantea(Batsch ex Pers.)Lloyd、紫色马勃Calvatialilacina(Mont.et Berk.)Lloyd的干燥子实体，能够清肺利咽、止血，用于治疗风热郁肺咽痛，音哑，咳嗽；外治鼻衄，创伤出血[1]。马勃中所含马勃多糖被证实在抗肿瘤方面有良好的效果[2]，大马勃中还含有丰富的蛋白质和多种人体必需氨基酸[3]，且大马勃的菌株在经过液体发酵培养后，其镇痛、抗炎的作用增强[4]。由于菌类分布较广泛、形态简单难鉴别，故市售的马勃经常出现乱用、混用的现象。

图1 马勃药材照片

目前市面上常见的混伪品主要有小马勃LycoperdonpusillumBatsch ex Pers.[5]、豆包菌Pislithustinctorius(Pers.)Coker & Couch.[6]、头状秃马勃Calvatiacraniiformis(Schw.)Fries.、网纹马勃LycoperdonperlatumPers[7]、白秃马勃Calvatiacandida(Rostk.)Hollos、梨形马勃LycoperdonpyriformeSchaeff es Pers.、铅色灰球菌BovistaplumbeaPers.、树皮丝马勃Mycenastrumcorium(Guess.ex DC.)Desv.、长根静灰球菌Bovistellaradicata(Dur.et Mont.)Pat[8]。

DNA条形码技术(DNA barcoding)是利用基因中一段特定的相对较短的，并且拥有高稳定性和重复性的序列来进行物种鉴定的一种分子生物学技术[9]。该技术作为传统鉴定技术的有效补充，可为中药材的鉴定提供准确的结果[10]。目前，该技术在已经在植物分类、中药材鉴定等多个领域得到广泛的应用，其准确性也已得到验证，并已成功应用于蔓荆子、蟾皮、血竭、车前子、羌活等多种中药材的鉴别中[11～15]，其对于控制药材市场药品的安全、准确具有很重要的作用[16]。

由于不同种类的真菌在外表上相对于动植物来说难以区分，且许多真菌分布广泛、来源复杂，所以使得真菌的鉴别更加困难[17]。目前真菌类中药材已经越来越多地应用于临床，为了保证药材的真实有效以及用药安全，目前常规的鉴别手段也存在一定的局限性，故我们急需更为准确的鉴定手段。研究发现，ITS序列在真菌鉴别中具有一定的优势，而COI序列含有较多内含子，不利于扩增，并不适用于成为全部真菌鉴定的条形码[18]。通过比较ITS序列与COI序列的应用，发现ITS序列在真菌中的鉴别范围更加广泛[19]，也表现出了更好的鉴别能力[20]。

本研究以马勃药材及其常见混伪品作为研究对象，获得其ITS序列，以准确鉴别真菌类药材马勃及其混伪品。

1 材料与方法

1.1 材料 本实验通过实地采集、药材市场购买等方式收集马勃共3个物种21份药材，分别来自重庆、北京、河北等地，样品信息见表1。另从GenBank数据库下载35条序列，详细信息见表2。

表1 样品信息表

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取 取干燥马勃药材20 mg，用核分离液(2%PVP，20 mmol/L EDTA，100 mmol/L pH 8.0 Tris-Hcl和0.7 mmol/L NaCl)800 μL抽提2次，利用基因组DNA提取试剂盒(Tiangen Biotech Co.,China)提取DNA。

1.2.2 PCR扩增及测序 采用ITS通用引物ITS1-18S(5' -TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3' )和ITS4-28S(5' -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3' )扩增，PCR反应体系为25 μL，包括2×Tag PCR Mix 12.5 μL，2.5 μmol/L引物各1.0 μL，DNA模板2.0 μL，ddH2O 8.5 μL，扩增程序为94 ℃ 85 s，(95 ℃ 35 s，55 ℃ 55 s，72 ℃ 45 s)循环35次，72 ℃ 10 min。PCR扩增产物经1%琼脂糖电泳检测并纯化后，使用ABI 3730XL测序仪(Applied Biosystems Co,USA)进行双向测序。

1.2.3 数据处理 测序峰图文件用CodonCode AlignerV4.2(CodonCode Co.,USA)进行序列拼接和剪切，去除低质量序列，获得ITS序列。将所得ITS序列使用MEGA5.0软件进行序列比对分析。基于K2P(Kimura 2-Parameter)模型计算种内种间遗传距离，并对马勃药材及其混伪品进行遗传距离分析，并构建Neighbor-Joining(NJ)系统聚类树，采用bootstrap重复1000次进行检验。

表2 GenBank下载序列

2 结果

2.1 马勃及其混伪品的种内变异分析 脱皮马勃、大马勃、紫色马勃、白秃马勃、头状秃马勃、网纹马勃、小马勃、梨形马勃、铅色灰球菌、树皮丝马勃、长根静灰球菌、豆包菌的ITS序列长度、种内变异位点数、GC含量等信息见表3。大马勃共7条序列，长度为609 bp，没有变异位点。脱皮马勃共7条序列，长度为609 bp，以YC0777MT14为主导单倍型，在22 bp处存在C-T变异，在494 bp处存在A-G变异。紫色马勃共7条序列，长度为607 bp，以YC0809MT01为主导单倍型，在388 bp处存在A-G变异；在395 bp处存在G-A变异。

2.2 马勃种内、种间及其与混伪品的种间遗传距离分析 基于K2P模型计算遗传距离见表4，大马勃、脱皮马勃和紫色马勃的种内最大遗传距离小于它们分别和混伪品的种间最小遗传距离，大马勃、脱皮马勃和紫色马勃的种间最小遗传距离大于大马勃、脱皮马勃和紫色马勃的种内最大遗传距离。

表3 马勃及其混伪品ITS序列特征

表4 马勃药材种内、种间及其与混伪品的种间遗传距离分析

2.3 马勃与其混伪品的NJ树鉴定 基于ITS序列构建马勃药材与其混伪品NJ树(图2)，结果表明，ITS序列能够很好的将马勃药材与其混伪品区分开来。

图2 基于ITS序列构建马勃药材及其混伪品的NJ树

3 讨论

马勃药材为灰包科真菌脱皮马勃LasiosphaerafenzliiReich.、大马勃Calvatiagigantea(Batsch ex Pers.)Lloyd、紫色马勃Calvatialilacina(Mont.et Berk.)Lloyd的干燥子实体，其形态与白秃马勃、头状秃马勃、网纹马勃、小马勃、梨形马勃、铅色灰球菌、树皮丝马勃、长根静灰球菌、豆包菌非常相近，容易发生混用的现象。其中豆包菌又叫彩色豆马勃，它是一种有益的外生菌根，能够增强树木的营养吸收能力及抵抗力[21]。因此，马勃药材的准确鉴定对市场上马勃药材的使用和流通的安全性与规范性有着非常大的意义。目前，对于马勃类药材的鉴别多数为传统的形态鉴别、显微鉴别等手段[22]，但这些技术手段存在一定局限性，而DNA条形码技术具有很强的适用性与通用性，利用该技术，可以更加稳定和准确保证马勃药材的质量，也保证了临床用药安全。

本研究收集了来自重庆、北京、河北、内蒙、广西、浙江、安徽、湖北、新疆等地的马勃药材样品，选用ITS序列作为DNA条形码对马勃药材及其混伪品进行鉴定研究。应用基于K2P计算的遗传距离对马勃药材种内、种间及其混伪品的种间遗传距离进行比较、分析结果表明，马勃药材的种内最大K2P遗传距离小于马勃药材与其混伪品的种间最小K2P遗传距离，构建NJ树，马勃药材和其混伪品各自聚为一支，表现出良好的单系性，同时马勃药材与其混伪品可以区分开来。因此，应用DNA条形码技术能够准确的鉴别马勃药材与其混伪品。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典(第一部)[S].北京:中国医药科技出版社,2015:50.

[2]姜明华,田易玲,徐凌川.马勃多糖对荷瘤模型小鼠抑瘤作用及生命延长率的影响[J].山东中医药大学学报,2014,38(2):157-158.

[3]张江萍,范晓龙,吴锐.山西野生大马勃营养成分分析[J].山西农业科学,2013,41(5):456-457.

[4]张帆，王大可，李爱欣,等.大马勃抗炎镇痛及体外抑菌作用的研究[J].中国食用菌,2014,33(2):50-52.

[5]游黔平,陈昆先.马勃及其伪品小灰包的鉴别[J].时珍国医国药,2006,17(3):349.

[6]余昕,张丹.浅谈4种真菌类中药的真伪鉴别[J].山西中医,2009,12(25):48-50.

[7]芮正祥.安徽中药志第三卷[M].合肥:安徽科学技术出版社,2005:353.

[8]国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草(第一册)[M].上海:上海科学技术出版社,1999:609-612.

[9]陈士林,庞晓慧,姚辉,等.中药DNA条形码鉴定体系及研究方向[J].世界科学技术-中医药现代化,2011,13(5):747-754.

[10]陈士林,姚辉,韩建萍,等.中药材DNA条形码分子鉴定指导原则[J].中国中药杂志,2013,38(2):141-147.

[11]张晓存,徐迪,孙伟,等.蔓荆子药材及其混伪品DNA条形码鉴定研究[J].世界科学技术-中医药现代化,2014,16(11):2366-2370.

[12]樊佳佳,宋明,宋驰,等.中药材蟾皮及其混伪品的DNA条形码鉴定研究[J].中国药学杂志,2015,50(15):1292-1296.

[13]王俊,刘霞,孙伟,等.名贵中药材血竭的DNA条形码研究[J].中国药学杂志,2015,50(15):1261-1265.

[14]宋明,张雅琴,林韵涵,等.基于ITS2和psbA-trnH序列对细小种子类药材车前子的鉴定比较[J].中国中药杂志,2014,39(12):2227-2232.

[15]张改霞,金钺,贾静,等.药用植物羌活种子DNA条形码鉴定研究[J].中国中药杂志,2016,41(3):390-395.

[16]辛天怡,李西文,姚辉,等.中药材二维DNA条形码流通监管体系研究[J].中国科学:生命科学,2015,45(7):695-702.

[17]张宇,郭良栋.真菌DNA条形码研究进展[J].菌物学报,2012,31(6):809-820.

[18]周均亮,赵瑞琳.真菌DNA条形码技术研究进展[J].微生物学通报,2013,40(8):1468-1477.

[19]KEITH A.SEIFERT.Progress towards DNA barcoding of fungi[J].Molecular Ecology Resources,2009,9(1):83-89.

[20]Dentinger BT，Didukh MY，Moncalvo JM.Comparing COI and ITS as DNA barcode markers for mushrooms and Allies(Agaricomycotina)[J].PLoS One,2011,6(9)：e25081.

[21]周爱东,吴小芹,王明生,等.彩色豆马勃硝酸还原酶基因克隆与序列分析[J].南京林业大学学报：自然科学版,2013,37(6):22-26.

[22]刘信奎,孙伟,矫明昭.中药饮片马勃质量标准的改进[J].中国保健营养,2012(7):241.

(2016-04-12收稿 责任编辑：洪志强)

Identification of Lasiosphaera Calvatia and Its Adulterants Using ITS Barcode

Zhang Jiali1,3，Huang Yuhang1，Song Ming2，Ren Yangyang1，Zhang Mengting1，Liu Xia1，Sun Wei3，Chen Shilin1,3

(1SchoolofChemistry，ChemicalEngineeringandLifeScience，WuhanUniversityofTechnology，Wuhan430070，China; 2Amway(China)BotanicalResearchandDevelopmentCenter,Wuxi214145，China; 3InstituteofChineseMateriaMedica，ChinaAcademyofChineseMedicalSciences，Beijing100700，China)

Objective:ITS sequence was used as a barcode to identify Lasiosphaera Calvatia and its adulterants.Methods:We collected 21 samples of Lasiosphaera Calvatia and extracted their DNA，then amplified their ITS sequences.We also downloaded sequences of Lasiosphaera Calvatia’s adulterants from GenBank.Sequences were assembled and analysis their variable sites.The Kimura 2-Paramter(K2P)genetic distances and compute the Neighbor-joining(NJ)phylogenetic tree were computed.Results:The maximum intraspecific K2P genetic distances of the ITS sequence of Calvatia gigantea(Batsch ex Pers.)Lloyd is 0.The maximum intraspecific K2P genetic distances of the ITS sequence of Lasiosphaera fenzlii Reich.is 0.003.The maximum intraspecific K2P genetic distances of the ITS sequence lengths of Calvatia lilacina(Mont.et Berk.)Lloyd is 0.003.The minimum interspecific K2P genetic distances of Calvatia gigantea and adulterants is 0.019，Lasiosphaera fenzlii and adulterants is 0.031，while Calvatia lilacina and adulterants is 0.634.The maximum intraspecific genetic distances of Calvatia gigantea、Lasiophaera fenzlii and Calvatia lilacina were all less than the minimum interspecific genetic distances of themselves and their adulterants.the NJ tree based on ITS sequence showed that Calvatia gigantea、Lasiosphaera fenzlii and Calvatia lilacina can gather into a branch sperately.Conclusion:ITS sequence was able to identify Lasiosphaera Calvatia from their adulterants,which is suitable in the identification of Lasiosphaera Calvatia and its adulterants.

Lasiosphaera Calvatia，ITS，adulterants，Barcoding

国家重大科技专项子课题“中药新药安全性检测技术与标准研究”——中药原料药混伪品分子基因鉴定技术与标准(编号：2014ZX09304-307-001-020)

张嘉丽(1993.3—)，女，硕士研究生，研究方向：中药资源与分子鉴定

陈士林，男，研究员，主要研究方向：中药资源与分子鉴定，Tel:(010)64058460,E-mail：slchen@icmm.ac.cn

R282

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.01.006