蒌蒿乙酸乙酯部位体外抗乙型肝炎病毒的实验研究*

罗文艳　段和祥

（1南昌大学第四附属医院药剂科　江西　南昌　330003；2江西省药品检验检测研究院　南昌　330029）

蒌蒿乙酸乙酯部位体外抗乙型肝炎病毒的实验研究*

罗文艳1段和祥2#

（1南昌大学第四附属医院药剂科江西南昌330003；2江西省药品检验检测研究院南昌330029）

目的：研究蒌蒿乙酸乙酯部位体外抗乙型肝炎病毒（HBV）的作用。方法：蒌蒿药材用95%乙醇提取后，用乙酸乙酯萃取获得有效部位，作用于HBV-DNA转染的HepG2.2.15细胞上。采用MTT法检测乙酸乙酯部位对HepG2.2.15细胞的半数抑制浓度（IC50），用ELISA法观察乙酸乙酯部位对HepG2.2.15细胞分泌HBsAg和HBeAg表达的抑制作用。结果：蒌蒿乙酸乙酯部位对HepG2.2.15细胞有一定的细胞抑制作用，对HepG2.2.15细胞分泌HBsAg和HBeAg表达有不同程度的抗原抑制作用。结论：蒌蒿乙酸乙酯部位有较强的抗乙型肝炎病毒作用。

乙型肝炎病毒；蒌蒿乙酸乙酯部位；乙型肝炎病毒表面抗原；乙型肝炎病毒e抗原

1　仪器与材料

1.1仪器设备Forma3131三气细胞培养箱（Thermo Fishier公司），ST-360酶标仪（上海科华实验系统有限公司），KQ-500E型超声波清洗器（昆山市超声波仪器有限公司），ST16R低温离心机（Thermo Fishier公司），Synergguv超纯水仪（Millipore公司），净化工作台（苏州净化设备有限公司）。

1.2材料蒌蒿药材采自鄱阳湖畔草滩，经江西省药品检验检测研究院袁桂平主任中药师鉴定为菊科蒿属植物蒌蒿的全草。DMEM培养基、胎牛血清购于美国GIBCO公司；胰蛋白酶、二甲基亚砜（DMSO）、四甲基偶氮唑蓝（MTT）均购于Sigma公司；青霉素、链霉素（上海先锋药业有限公司）；HBsAg检测试剂盒、HBeAg检测试剂盒（美国BD公司）；其余试剂均为分析纯。

1.3细胞株及细胞培养HepG2.2.15是HBV-DNA细胞转染HepG2而建立的HepG2.2.15细胞株，由军事医学科学院放射与医学辐射学研究所提供，培养基为DMEM高糖型培养基，含10% FBS，0.2 mg/ml的G418，用前加入100 U/ml青霉素和100 U/ml链霉素。

2　方法

2.1样品的制备称取鲜蒌蒿1.0 kg，切碎，晾干，用95%乙醇回流提取2次，每次2 h，合并回流液，回收乙醇，浓缩至干浸膏，加适量的水使溶解，依次用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯萃取，弃去石油醚与三氯甲烷萃取液，取乙酸乙酯萃取液，浓缩蒸干，即得蒌蒿的乙酸乙酯部位。

2.2细胞培养在长满HepG2.2.15细胞的培养瓶内加0.25%胰蛋白酶消化、传代、保种。取对数生长期的细胞用DMEM高糖型培养基制备成1×105个/ml的混悬液，按每孔100 μl接种于96孔细胞培养板中，置37℃，饱和湿度，5%CO2培养箱中培养24 h，待细胞长成单层后，每孔加入含有不同浓度的药物（蒌蒿乙酸乙酯部位用培养基系列倍比稀释，制备成0.004、0.02、0.1、0.5、2.5、12.5、62.5 mg/ml等7个不同浓度），每个浓度平行4个孔。同时设细胞对照组（不含药液的细胞培养液）及空白对照组（仅含培养液）。将96孔细胞培养板放回培养箱培养，每2天更换1次新鲜的培养液，10 d后，取上清液，用ELISA法计算抗原抑制率，余下细胞用MTT法测定半数抑制浓度（IC50）。

2.3细胞培养结果测定取“2.2”项下的上清液，根据ELISA试剂盒说明书操作，采用酶标仪于450 nm的波长处测定OD值。余下细胞，每孔加0.2 ml新鲜配制的含有0.2 ml MTT的无血清培养基，在37℃继续培养4 h后，以3 000 r/min的速度离心5 min，倒出上清液，加0.2 ml DMSO溶解MTT甲臜沉淀，超声5 min后，用酶标仪于570 nm下测定OD值。按（1-OD给药组/OD对照组）×100%计算抑制率。

2.4统计学处理采用SPSS20.0统计学软件分析，试验数据均以（±s）表示，采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

3　结果

药液对HepG2.2.15细胞的IC50值为2.55 mg/ml，对HepG2.2.15细胞分泌HBsAg和HBeAg的IC50值分别为48.52 mg/ml和1.86 mg/ml。见表1。

表1　蒌蒿提取物乙酸乙酯部位对HepG2.2.15细胞及其分泌HBsAg、HBeAg的抑制作用（±s）

表1　蒌蒿提取物乙酸乙酯部位对HepG2.2.15细胞及其分泌HBsAg、HBeAg的抑制作用（±s）

注：与空白对照组比较，*P＜0.05。

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4　讨论

由表1的结果可见，蒌蒿提取物乙酸乙酯部位对HepG2.2.15细胞及其分泌HBsAg、HBeAg具有明显的抑制作用，并且抑制率的大小与浓度成正比。这为进一步分离、纯化、鉴定乙酸乙酯部位抗乙型肝炎病毒的活性成分提供了理论依据和技术支持。本课题组前期研究了蒌蒿乙酸乙酯部位的化学成分，并首次从蒌蒿药材中分离鉴定出反式白藜芦醇等11种化学成分[8]。白藜芦醇是一种生物活性很强的天然多酚类物质，查阅相关文献[9]，也发现白藜芦醇及其衍生物有一定的抗乙型肝炎病毒的作用。

乙型肝炎是一种损害肝脏的病毒感染，可造成急性或慢性疾病。从中国疾病预防控制中心获悉，我国现有约9000万慢性乙肝病毒感染者，其中约2800万为慢性乙肝患者，每年约有90万发展为肝硬化，约30万发展为原发性肝癌。在全球肝癌发病和死亡人数最多的20个国家中，我国排在首位。我国人口约占全球人口的20%，但肝癌发生及死亡人数占全球的50%以上。虽然我国中药资源非常丰富，但从广阔的中药资源库中研究并开发出一种高效低毒的抗HBV的药物，还有很长一段路要走。

目前，通常是利用活性指导下的靶向追踪分离技术，把目标药物作用于HBV-DNA转染的HepG2.2.15细胞，用MTT法检测目标药物对HepG2.2.15细胞的IC50，用ELISA法观察目标药物对HepG2.2.15细胞分泌HBsAg和HBeAg表达的抑制作用。本研究结果为进一步研究抗乙型肝炎病毒的活性化学物质基础，得到一系列抗乙型肝炎病毒的活性成分，研究和开发具有自主知识产权的高效低毒的抗肿瘤药物奠定了基础。

[1]中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志(第七十六卷第二册)[M].北京:科学出版社,1991.144

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Experimental study on Ethyl Acetate Fraction from Artemisia selengensis anti-HBV in vitro

LUO Wen-yan1,DUAN He-xiang2#
(1Department of Pharmacy,The Fourth Affiliated Hospital of Nanchang University,Nanchang330003; 2Jiangxi Institute for Drug Control,Nanchang330029)

Objective:To study the effect of ethyl acetate from Artemisia selengensis anti-HBV in vitro.Methods:After the Artemisia selengensis were extracted with 95%ethanol,extracted with ethyl acetate.Then the effective part was acted on HBV-DNA transfected HepG2.2.15 cells.MTT assay was used to detect ethyl acetate fraction inhibitory concentration 50%of HepG2.2.15 cells. ELISA method was used to investigate the suppressor effect on HBsAg and HBeAg in the cultured HepG2.2.15 cells which were gene transferred with HBV.Results:Ethyl acetate fration from Artemisia selengensis have a certain cell inhibitory effect on HepG2.2.15 cells. HepG2.2.15 cells the secretion of HBsAg and HBeAg express different degrees of antigen inhibition.Conclusion:The ethyl acetate from Artemisia has strong anti HBV effect.

HBV;Ethyl Acetate Fraction from Artemisia selengensis;HBsAg;HBeAg

R285.5[1]。全草入药，性平味甘，有止血消炎、镇咳化痰、开胃健脾、散寒除湿等功效[2]。目前，针对蒌蒿的研究主要集中在抗菌、抗氧化、降压、抗肿瘤等活性物质及其药理活性方面[3～7]，而蒌蒿抗乙型肝炎的功效，尚未引起人们的重视。本试验采用MTT法和酶联免疫吸附试验法（ELISA），研究了蒌蒿乙酸乙酯部位对体外乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）和乙型肝炎病毒e抗原（HBeAg）的抑制作用。现报告如下：

B

10.13638/j.issn.1671-4040.2016.09.045蒌蒿（Artemisia selengensis Turcz.ex Bess.）为菊科（Compositae）蒿属（Artemisia Linn.）植物，俗名藜蒿，在我国各地均有分布，但以生长在长江中下游的鄱阳湖、洞庭湖和太湖等地区的品质为佳

江西省卫生厅中医指导性计划（编号：2013B014）；

江西省科技厅青年科学基金资助项目（编号：20122BAB215044）

段和祥，E-mail：duanhx_007@163.com

（2016-06-02）