转抗旱基因IrrE玉米材料的获得及抗性鉴定

余桂容，张 维，杜文平，宋 军，陈 谦，徐利远*

(1.四川省农业科学院生物技术核技术研究所，四川 成都 610066；2.中国农业科学院生物技术研究所，北京 100081)



转抗旱基因IrrE玉米材料的获得及抗性鉴定

余桂容1，张 维2，杜文平1，宋 军1，陈 谦1，徐利远1*

(1.四川省农业科学院生物技术核技术研究所，四川 成都 610066；2.中国农业科学院生物技术研究所，北京 100081)

以优良玉米自交系综31的幼胚为受体材料, 采用农杆菌介导法将来自微生物耐辐射奇球菌(Deinococcusradiodurans)的抗旱基因IrrE转入玉米幼胚组织细胞中, 转化后的细胞通过抗性筛选, 分化再生成苗。结果表明，经特异PCR检测，42株植株转入了IrrE基因，有29株收获种子。T1代在温室大棚控制水肥试验及脯氨酸等生理生化指标检测表明, 转基因植株具有良好的耐旱特性, 为抗旱玉米新品种选育提供了较好的亲本材料。

玉米幼胚; 遗传转化; 抗旱鉴定;IrrE基因

玉米已成为我国的第一大粮食作物，种植面积达到0.2×108hm2，在国民经济中占有举重轻重的地位。近年来，由于人口增长，水资源污染，水源利用率低，温室效应等原因，再加上水资源本身就有限，使得水资源日益紧缺，我国每年受干旱危害面积达2×107hm2，干旱严重制约了我国农业的可持续性发展。大量研究表明选育优良抗逆作物新品种是提高作物的产量、改善品质、增强作物抵御不良环境的根本途径。转基因育种技术与传统育种技术相比，缩短了育种周期，不同来源(动植物、微生物)基因整合到宿主植物中，拓宽了作物遗传改良中可利用的基因资源能提高植物抗逆性能的基因。因此，通过基因工程手段进行玉米抗旱基因重组，进行转基因抗旱育种，培育出对干旱有更强适应能力的品种，是当前追求的一个十分重要的目标，也是目前国内外同行研究的热点问题。

植物抗逆抗旱有多种机制，IrrE是一个与抗逆相关的全局性调控蛋白。美国Battista实验室的Earl和日本Narumi实验室的Hua先后报道了从D.radiodurans中分离得到编码D.radiodurans特有蛋白DR0167的基因，命名为IrrE和pprl。该基因的缺失会引起D.radiodurans电离辐射抗性的显著下降[1-2]。进一步研究发现，IrrE是该菌的DNA损伤修复的总开关蛋白，蛋白组学研究显示该蛋白还具有总体调控胁迫响应、能量代谢、转录调控、信号传递等作用[3]。中国农科院林敏、潘婕等研究发现，除了能有效提高大肠杆菌的辐射抗性和氧化抗性外，IrrE还能够增强大肠杆菌的抗逆性能以及植物的耐盐能力[4]。他们选用在十字花科植物中耐盐性较高的甘蓝型油菜为研究材料，转基因当代的油菜经 350 mM 的NaCl的盐胁迫处理，能正常开花、结实。后代经PCR 的检测，Southern 杂交实验证实IrrE基因能在后代中遗传，并且基本符合孟德尔规律(3∶1)。经Northern 杂交实验证明IrrE基因能在后代中表达。经 350 mM 的NaCl的盐胁迫，仍能正常开花、结实，其农艺性状没有发生变化。同时，还对转IrrE基因油菜进行了初步的抗旱实验，转基因油菜能存活，并且复水后转基因油菜能开花、结实[5]。这一初步结果研究证明IrrE蛋白不但能提高宿主的耐盐性能，还能大幅度增加宿主的耐干旱能力，在转基因耐盐、抗旱作物研究上拥有巨大的潜力。

本试验运用IrrE基因即抗旱基因构建高效表达载体，通过农杆菌介导法将重组载体转入玉米自交系综31的幼胚，试图获得玉米转基因植株，再经过田间表型及生理生化检测等抗旱性鉴定，筛选出抗旱的转基因玉米材料，为抗旱玉米新品种的育种创制基础材料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

转基因受体材料玉米自交系综31:由中国农科院作物所王国英老师课题组提供后自行繁育的种子。

1.2 植物表达载体构建及玉米转化

抗旱基因IrrE及其载体pRADZ3由中国农科院生物所林敏老师课题组提供，转化方法参照文献[6]。

1.3 转基因苗的分化再生及PCR鉴定

设计IrrE基因PCR引物序列如下：Z3-irrE1-do:5′ TACATATGGTTCACTGTGCAGCGTC 3′

Z3-irrE2-up:5′ TAACTAGTATGGGGCCAAAAGCTAAAG 3′。

PCR退火温度52 ℃，延伸时间为1 min，扩增片段951 bp(IrrE全长片段1005 bp)。

1.4 T1代转基因幼苗的梯度量化控水试验

温室大棚内，中度胁迫(盆栽土壤含水量为田间最大持水量40 %左右，试验田土壤田间最大持水量为25 %)。选择15份玉米抗旱转IrrE基因材料

(T1～T15)和1个非转基因的对照材料(CK)从苗期至开花期对盆钵进行控水，植株以中午萎蔫，早晚舒展为度，作为控水和调查处理标准。控水后开始量化复水，通过反复干旱控制水分观察苗期萎焉程度及进行相关生理指标测定。

1.5 抗旱生理指标测定

1.5.1 脯氨酸含量测定 待试验材料幼苗长至5叶期时进行干旱处理,待对照品种萎蔫无法自然恢复时,统一供水恢复,分别采集各品种干旱处理前、后(间隔7 d)的叶片,进行脯氨酸含量测定，通过茚三酮法[7]。先做脯氨酸测定的标准曲线，按照公式y=0.056x+0.024(R2=0.992)，y为脯氨酸含量(μg/g),x为吸光度值进行换算。

1.5.2 玉米开花-抽丝时间间隔(ASI)测定 在抽雄吐丝期开进行田间调查，记录雌雄穗开花间隔时间。

1.5.3 绿叶面积和株高 在抽雄吐丝期用卷尺测量整株玉米绿叶面积并且记录数据，利用公式：叶面积 = 叶长 × 叶宽 × 0.75 计算单片叶面积，然后求和得到整株叶面积。成株期测定株高。每个材料选取其中 5株求其平均值。

1.5.4 产量性状 每个材料选取其中 5个果穗，考查每穗穗长、穗粒数、百粒质量、籽粒晒干后采用 DA7200型近红外光谱仪测定籽粒含水量，将含水量统一折算为 14 %计算单株穗粒质量。

2 结果与分析

2.1 T0代玉米转基因苗的分化再生及PCR鉴定

通过农杆菌介导转化抗旱基因IrrE至玉米自交系综31的幼胚中，经恢复、筛选、分化再生出转化苗如图1，移栽成活后取其幼叶提取DNA进行PCR验证结果如图2，将PCR验证为阳性苗的植株精心栽培，收获T0代转化穗子如图3。

图1 抗旱基因IrrE转化玉米幼胚再生苗Fig.1 Regenerated plants from the drought- resistant gene IrrE transformed maize immature-embryos

M为MARKER，1～8为转化苗，其中1～5和8是阳性苗，6和7为阴性苗M: MARKER, 1-8: The transgenic corn seedlings, including 1-5 and 8 were positive seedlings, 6 and 7 were negative seedlings图2 转抗旱基因IrrE玉米苗PCRFig.2 PCR result of drought-resistant gene IrrE transgenic corn seedlings

图3 转抗旱基因IrrE玉米T0代穗子Fig.3 Ear of drought-resistant gene IrrE transgenic T0 corn

2.2 T1代转基因幼苗的梯度量化控水抗旱表现

温室大棚内，通过反复干旱及量化控制复水试验检测表明, 从外形萎焉度可以直观地看出转基因植株具有良好的耐旱特性(图4)。不同的转化事件T1代抗性表达量不一样，根据萎焉比例和程度不同，可分为高抗，中抗和敏感(同等情况下复水时不能完全恢复的材料为敏感)，见表1。

2.3 转基因玉米材料的抗旱生理指标测定

2.3.1 脯氨酸含量测定 将表1中不同抗性程度的转基因玉米材料分别选取2份作为代表来进行生理指标测定。T3，T4作为高抗代表，T2，T14作为中抗的代表，T13,CK作为敏感的代表。

叶片脯氨酸含量明显升高(表2)，其中通过叶片萎焉度筛最抗的T3材料升高最多，达到38.5 ng/g，可以看出越是抗旱转基因株系的叶片中积累了更多的溶质，具有较强的渗透调节能力，可以减轻渗透胁迫对玉米造成的伤害，脯氨酸属于渗透保护物质。这与前人研究的玉米脯氨酸含量增加越多，则判定玉米品种的抗旱性越强的结论是一致的[8]。

CK为非转基因的野生型，其余为转基因T1代CK: Non-transformed wild-type gene, the rest of transgenic T1图4 T1代转抗旱基因IrrE玉米苗抗旱分离情况Fig.4 Drought-resistance separation of T1

抗旱性表型(萎焉度)Drought⁃resistancephenotype(wiltdegree)材料代号MaterialNo．高抗HighresistanceT3，T4，T8，T6，T11，T12中抗ModerateresistanceT2，T14，T9，T5，T15，T10，T7，T1敏感SensitiveT13，CK

2.3.2 转基因玉米开花-抽丝时间间隔(ASI)测定 玉米的抽雄吐丝期是玉米对水分需求最为关键的时期即需水临界期，在这个时期对干旱胁迫非常敏感(表3)，如果在抽雄吐丝期受到干旱胁迫会使玉米雌花抽丝延迟，雄花的花粉活力降低，最终导致产量下降。从表3可见,抗旱性越好的材料ASI越短，T3只有2 d左右，而对照高达5.5 d。

2.3.3 绿叶面积和株高 干旱胁迫对玉米植株光合作用的影响表明，转抗旱基因抗性较强的植株在干旱胁迫下长势更好，株高较高，有较好的光合作用。玉米在受到干旱胁迫时，由于水分的丧失或供给不足，在形态上首先表现在叶片上，即抑制叶片生长是玉米叶片难以伸展，造成玉米叶片面积的减小，进而影响到其他的方面，最终造成减产。由表4可见，抗旱性越好的转基因材料，在株高和绿叶面积方面的优势越强。

表2 干旱胁迫对玉米叶片脯氨酸含量的影响

表3 干旱胁迫对玉米转基因材料开花-抽丝时间间隔(ASI)的影响

表4 干旱胁迫对不同玉米转基因材料绿叶面积和株高的影响

2.3.4 产量性状 非转抗旱基因的玉米对照的籽粒产量明显比转基因的籽粒产量降低，不同转基因玉米材料间产量及其受干旱影响的程度有较大差异。玉米的产量是生产上的重要指标，通过对籽粒产量的获得与分析，可以直观的得到一定的结果，从而判断玉米材料的抗旱性。在缺水情况下，玉米的生长发育受到一定的限制，最终表现在产量上。在不同水分胁迫下，玉米由于受到干旱胁迫导致最终产量的差异(表5)。单株平均产量表明最抗的材料比对照增产20 g左右。

3 讨 论

通过转基因作物获得的耐旱性状被看作是全球转基因作物商业化的第2个10年内(2006年至2015 年) 及将来能够获得商业化的最重要的性状，因为到目前为止，耐旱性是提高全球作物产量的一个最重要的制约因素。2013年，孟山都公司已在美国推出第一种也是最先进的生物技术转基因耐旱玉米[12]。

外形萎焉度等形态指标是一种利用作物长势、长相来进行作物缺水诊断的定性方法。由于作物生长对水分亏缺比较敏感，可以采用经验方法，根据作物的长势、长相来进行作物旱情诊断,作物形态指标直观，观测方便。干旱时卷叶程度也是抗旱的形态结构指标之一。作物在水分胁迫下有自我调节能力，水分亏缺下作物的细胞膨压降低而产生卷叶，叶片卷曲程度在不同玉米品种间有明显差异,因此可用于鉴别抗旱性强弱。叶片卷曲程度可以作为玉米的重要抗旱性指标[9]。

脯氨酸是目前所知分布最广的渗透保护物质,动物、植物、真菌、藻类中都有脯氨酸的累积。在逆境条件下(旱、盐碱、热、冷、冻、紫外线以及重金属等),脯氨酸合成的增加会导致植物体内脯氨酸大量累积,植物通过提高体内脯氨酸的含量调节渗透平衡,从而保护细胞的结构,很多实验证明脯氨酸的累积与植物对环境胁迫的耐受能力正相关[8，10-11]，抗旱性强的品种往往积累较多的脯氨酸，因此测定脯氨酸含量可以作为抗旱育种的生理指标。

玉米的抽雄吐丝期是玉米对水分需求最为关键的时期即需水临界期，如果玉米在抽雄吐丝期受到干旱胁迫的话，玉米的雌穗生长受到抑制，使其生长速率减慢、雌穗短小、苞叶紧缩、雌丝不能正常吐出，推迟了吐丝的时间，玉米的雄花也会因为干旱胁迫而难以散粉，或者造成花粉活力降低，延误了散粉的时机。这样会使抽雄吐丝间隔期增大，进一步使玉米结实率、千粒重和籽粒产量等下降。开花期具有时间短，兼顾营养和生殖生长阶段，对水分胁迫敏感，重复性强，易于活体鉴定，在进行抗旱筛选时玉米的抽雄吐丝间隔期可作为重要的指标进行选择分析。

本实验研究立足于我国西南地区的气候生态特点和干旱对玉米生产及增产的影响，综合国内外玉米抗旱研究的现状和趋势，以多个转基因玉米自交系为材料，采用人工控水处理进行抗旱鉴定试验，综合多个抗旱评价指标，对不同玉米材料进行生长发育、形态、生理生化的研究与评价，鉴定出一批抗旱性较强的转基因玉米自交系材料，为抗旱性玉米品种选育提供一定帮助，也是研究抗旱性玉米品种的基础与前提。更多抗旱性玉米材料的创制和改良以及抗旱转基因玉米品种的选育与应用有待进一步研究。

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(责任编辑 陈 虹)

Transgenic Drought-resistant GeneIrrEMaize Material Obtaining and Resistance Identification

YU Gui-rong1, ZHANG Wei2, DU Wen-ping1, SONG Jun1, CHEN Qian1, XU Li-yuan1*

(1.Institute of Biotechnology & Nuclear Techniques, Sichuan Academy of Agricultural Sciences, Sichuan Chengdu 610066, China; 2.Biotechnology Research Institute, China Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China)

Taken the maize inbred‘Zhong-31’as the transgenic receptor, the drought- resistant gene(IrrE) fromDeinococcusradioduransbyAgrobacterium- mediated was transformed into the immature-embryos of Zhong-31, its immature-embryos were screen out,differentiated and regenerated plants. The result showed thatIrrEin 42 transgenic plants from initial regenerated plants by PCR detection were identified, of which the seeds of their 29 plants were harvested. Based on the regulation of water and nutrients, the analysis of proline, and so on for T1, the results indicated that transgenic plants had well drought-resisting characters, which provided a good parent plants for drought resistant breeding of maize.

Maize immature-embryo; Transgenic; Drought- resistance identification;IrrEgene

1001-4829(2016)08-1782-05

10.16213/j.cnki.scjas.2016.08.005

2015-09-08

转基因生物新品种培育重大专项(2014ZX0800301B)；四川省农科院财政基因工程项目(2011JYGC01-002)；四川省农科院高新技术研究应用专项(2013GXJS-001)

余桂容(1971 -),女，四川荣县人， 副研究员,主要从事玉米基因工程育种，*为通讯作者: 徐利远, 研究员, 主要从事农作物遗传育种研究，E-mail: yuguirong@163.com。

S513

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