猪多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及药敏试验

2016-12-19林跃华

养猪 2016年2期

关键词：减肥法杀性碳水化合物

林跃华

（福建省漳州市农业局漳州市动物疫病预防控制中心，福建漳州363000）

猪多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及药敏试验

林跃华

（福建省漳州市农业局漳州市动物疫病预防控制中心，福建漳州363000）

从福建省某猪场发生以呼吸道病为主要特征的病死猪脏器中分离到1株可疑菌，通过细菌分离和纯培养、涂片镜检、生化试验、小鼠致死性试验、药敏试验，并设计1对检测猪多杀性巴氏杆菌的引物，对可疑菌做PCR检测。结果表明，可疑菌对小鼠有致死毒力；PCR检测结果与生化鉴定结果符合，可疑菌为猪多杀性巴氏杆菌；药敏试验检测结果显示，该菌对先锋霉素Ⅴ、阿米卡星、氟哌酸、氯霉素和庆大霉素高度敏感。

多杀性巴氏杆菌；分离鉴定；PCR；药敏试验

多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida,Pm）对多种动物均有致病性，属于巴氏杆菌科，主要使动物发生传染性肺炎或出血性败血症，感染猪后引起猪肺疫和猪传染性萎缩性鼻炎，是诱发猪呼吸道病综合征的重要致病因子之一，猪传染性萎缩性鼻炎主要是由产毒素多杀性巴氏杆菌或支气管败血波氏杆菌（主要是D型）引起的，而猪肺疫一般是由非产毒素多杀性巴氏杆菌引起的。该菌正常存在于多种动物的口腔和咽部黏膜，当动物处于应激状态和机体抵抗力下降时细菌大量繁殖并致病，发生内源性感染[1]，可与猪伪狂犬病、猪传染性胸膜肺炎、猪链球菌病、猪喘气病等发生混合感染或继发感染[2]。近年来，福建地区部分规模养殖场受多杀性巴氏杆菌与其他病毒和细菌混合感染和继发感染的侵害呈逐年上升趋势，为此，本次对福建地区的多杀性巴氏杆菌进行了分离鉴定、PCR检测及药物敏感性等试验，为该区域的猪群体感染多杀性巴氏杆菌病的治疗和预防提供参考。

1 材料

1.1 病料来源及试验时间、地点

2015年10月份，福建省某猪场的临床患病小猪，以10%甘油生理盐水浸润棉签采集鼻腔深部的分泌物，解剖病危小猪，采集肺脏、气管和淋巴结做病原诊断。本次试验的地点为福建省漳州市动物疫病预防控制中心，试验时间为2015年10—11月。

1.2 试剂与试验动物

化学药品主要有：胰蛋白大豆琼脂（TSA），革兰氏染料，瑞氏染料，糖发酵管和药敏试纸均购自杭州微生物试剂有限公司。

参照文献[3-4]设计如下1对引物，该引物扩增片段为457 bp，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。P1：5'-ATCCGCTATTTACCCAGTGG-3'；P2：5'-GCTGTAAACGAACTCGCCAC-3'。

Taq DNA聚合酶及PCR相关试剂购自TaKaRa。

猪巴氏杆菌阳性标准菌株（C48-1菌株）由四川农业大学动物检疫实验室保存并提供。

试验健康雌性小鼠（体重20 g左右）20只，购自福建农林大学。

2 方法

2.1 病原分离培养及纯化

将采集的小猪鼻腔分泌物棉拭子及肺脏、气管无菌条件下分别接种于胰蛋白大豆琼脂平板上，于37℃温箱中培养18～24 h后观察。挑取直径1～2 mm，光滑、湿润、透明的单个菌落进行革兰氏染色和瑞氏染色，于37℃温箱中培养18～24 h。对革兰氏染色为红色的细小杆菌及瑞氏染色为两极浓染的细菌为可疑菌落，对其传代纯化，进一步做生化鉴定、PCR鉴定、小鼠致死试验、药敏试验。

2.2 生化试验

对纯化好的可疑细菌进行生化试验：葡萄糖、果糖、甘露醇、麦芽糖、乳糖、鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、吲哚、硝酸盐、MR、VP，观察结果。

2.3 PCR检测

2.3.1 PCR模板用接种环挑取可疑菌落和猪巴氏杆菌阳性标准菌株（C48-1菌株），分别悬浮于含50 μL无菌水的离心管中，100℃水煮5～10 min，然后迅速置于冰上冷却5 min，10 000 r/min离心2 min，分别取上清液为PCR模板。

2.3.2 PCR反应体系采用25 μL的反应体系：10×Taq缓存液2.5 μL，25 mmol/L dNTPs 0.5 μL，20 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，无菌水10 μL，模板10 μL。

2.3.3 PCR反应条件95℃反应5 min；95℃30 s，56℃30 s，72℃40 s，进行35个循环；最后72℃延伸10 min，产物于8℃短时间保存。

2.3.4 PCR结果取反应产物各10 μL，于含EB的10 g/L琼脂糖凝胶中，90 V电泳30 min，然后在紫外线下观察。

2.4 纸片扩散法药敏试验

对纯化好的可疑细菌进行药物敏感性试验，操作方法和判定标准参照杭州天和微生物试剂有限公司的操作方法与标准。药敏纸片包括：氨苄青霉素、先锋霉素Ⅴ、阿米卡星、卡那霉素、链霉素、氟哌酸、四环素、妥布霉素、氯霉素、红霉素、庆大霉素、复方新诺明。

2.5 小鼠致死性试验

将可疑菌落接种于TSA平板培养24 h，纯化检验合格后，用PBS液洗脱菌苔，并稀释至1010CFU/mL，稀释菌液超声波破碎3次，每次10 s，破碎产物12 000 r/min，离心30 min，上清液依次通过0.45 μm和0.22 μm细菌过滤器过滤，进行平板计数。将上述小鼠随机分为试验组和对照组，每组5只，对试验组每只小鼠分别腹腔注射0.5 mL稀释菌液，同时对对照组每只小鼠腹腔注射0.5 mL生理盐水，72 h内观察小鼠死亡情况，并解剖病死小鼠，观察其病理变化，采集心、肺等病料组织涂片，分离细菌并鉴定。

3 结果与分析

3.1 细菌分离纯化及染色镜检

经培养18～24 h，胰蛋白大豆琼脂平板上长出针尖大小、露珠状、透明的菌落，革兰氏染色镜检为红色、两极浓染的短小杆菌，多单个存在；瑞氏染色镜检为蓝色、两极明显浓染的短小杆菌，见图1。

3.2 生化试验结果

纯培养物能发酵葡萄糖、果糖、甘露醇、麦芽糖，产酸不产气；不发酵麦芽糖、乳糖、鼠李糖；吲哚、硝酸盐还原试验为阳性；MR、VP试验为阴性。根据《伯杰氏细菌鉴定手册》的判定标准，分离的可疑菌落符合多杀性巴氏杆菌的生化特征。

3.3 PCR检测结果

用引物P1、P2扩增时，分离的可疑菌落和Pm阳性标准菌株（C48-1菌株）均有扩增出目的条带，且大小基本一致，经对分离的可疑菌落Pm阳性PCR产物回收测序，与NCBI上发布的序列对比，同源性为98.8%，结果见图2。

图2 PCR检测结果

3.4 纸片扩散法药敏试验

纸片扩散法药敏试验结果见表1。药物敏感试验表明，该菌对先锋霉素Ⅴ、阿米卡星、氟哌酸、氯霉素和庆大霉素高度敏感；对氨苄青霉素、卡那霉素、四环素、红霉素表现为中度敏感；对链霉素、妥布霉素、复方新诺明耐药。

表1 药敏试验结果mm

3.5 动物试验

小鼠致死试验中试验组5只小鼠72 h内全部死亡，小鼠死亡时间大多在15～40 h内，对照组小鼠没有死亡。取死亡小鼠心、肺接种于TSA平皿，结果分离出纯的经鉴定与以上一致的细菌。

4 讨论

本试验从福建省某猪场18份疑似病料，通过分离培养、染色镜检、生化试验、动物致死试验和PCR试验等，共分离到1株猪多杀性巴氏杆菌。由于猪场感染率高于分离率，说明福建部分地区已感染猪多杀性巴氏杆菌，猪巴氏杆菌病作为养猪业重要呼吸道疾病之一，对福建地区养猪业已构成潜在威胁。目前，养殖场长期、大量使用抗生素进行猪病防治，导致细菌的抗药性强，往往引发混合感染或继发感染，导致对细菌的分离培养难度加大，猪场的治疗效果也越来越差，因此应引起养猪业的高度重视。

本试验在细菌纯化和染色时，两极浓染并不明显，它的菌落和菌体形态特征与放线杆菌、溶血巴氏杆菌等细菌相似，都为革兰氏阴性杆菌，因此采用常规的染色和生化试验进行鉴定，难度较大。本文根据文献合成1对PCR引物，通过PCR鉴定技术和生化等试验，提高了分离鉴定猪多杀性巴氏杆菌的准确度，适合应用于该菌的流行性病学调查。

动物试验中，从试验结果看，可疑菌落培养物腹腔注射感染小鼠均在15～40 h内死亡，通过采集死亡小鼠脏器，再次进行细菌分离鉴定试验，结果与本次试验结果相同，说明本次分离的猪巴氏杆菌具有较强的感染率。

从药敏试验结果看，巴氏杆菌仅对先锋霉素Ⅴ、阿米卡星、氟哌酸、氯霉素和庆大霉素高度敏感，与文献[5-6]的报道有一定区别。由于该菌容易产生耐药性，且不同时间、不同地区、不同群体分离到该菌对药物的敏感性可能存在一定差异，而且现在大部分发病猪都普遍存在混合感染和多重感染，因此建议应先通过药敏试验选择敏感药物进行治疗，达到较好的治疗效果，避免因乱投药而产生较强耐药性，形成猪场难治的顽固症。

本试验设计的PCR引物，可直接从第1代培养皿上可疑菌做PCR检查，无需提细菌的基因组，最小检查猪巴氏杆菌病原CFU为103/mL，检测结果若为阳性，一般可分离出Pm，若为阴性则反之，耗时只需几小时，与传统的分离培养及鉴定相比，PCR检测大幅提升了该病的诊断速度，避免了费时、费力、漏检、错检等缺陷问题，显示了PCR技术对疾病的早期诊断、及时防治，对减少经济损失具有重要的意义。

[1]唐先春，吴斌，索绪峰，等.猪多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及生物学特性研究[J].畜牧兽医学报，2005，36（6）：590-595.

[2]徐引弟，王治方，朱文豪，等.猪多杀性巴氏杆菌的分离鉴定和药敏试验[J].中国兽药杂志，2011，45（5）：5-7.

[3]Townsend K M,Frost A J,Lee C W,et al.Development of PCR assays for species and type-specific identification of Pasteurella multocida isolates[J].J Clin Microbiol,1998,36(4): 1096-1100.

[4]Davies R L,Mac Corquodale R,Baillie S,et al.Characterization and comparison of Pasteurella multocida strains associated with porcine pneumonia and atrophic rhinitis[J].Journal of Microbiology,2003,52:59-67.

[5]邢明伟，曾祥伟，王希彪.猪多杀性巴氏杆菌的分离与鉴定[J].养猪，2010（2）：63-64.

[6]彭苗苗，傅胜才.猪多杀性巴氏杆菌的鉴定方法和耐药性的研究进展[J].河南畜牧兽医，2015（5）：8-10.

（编辑：郭玉翠）

低脂减肥法更有利健康

【英国《每日邮报》网站8月13日报道】题：低碳水化合物食品最有利于减轻体重，但低脂食品更有利于健康

减少碳水化合物的摄入也许有助于减轻体重，但减少脂肪的摄入有助于健康。

一项研究发现，当人们采用“阿特金斯减肥法”等低碳水化合物减肥法时，能减去更多体重。但采用低脂减肥法时，却能减去更多脂肪。

这是一个重要发现，因为减肥者往往只关注减轻体重，而对健康至关重要的是脂肪的数量。

尽管超市货架上低脂食品琳琅满目，但许多减肥者都对“阿特金斯减肥法”和“杜坎减肥法”等低碳水化合物减肥法情有独钟，他们相信，这些减肥法对减肥特别有效。

肥胖症专家希望这项发现有助于打破人们对土豆和面包等碳水化合物食品的误解。专家说：“消费者可以不再为日常生活中适当摄入碳水化合物而自责了。”

美国国家糖尿病、消化系统疾病和肾病研究所的科学家，在研究中比较了低碳水化合物减肥法与低脂减肥法的效果。

研究期间，19名患有肥胖症的男性和女性研究对象要在医院病房被隔离4周，其间，研究人员会观察并记录他们吃的每一口食物和进行的每一项锻炼。