不同工艺白金胶囊对慢性不可预知应激所致小鼠抑郁症的影响

倪博然，林龙飞，张慧，倪健

北京中医药大学，北京 100029

不同工艺白金胶囊对慢性不可预知应激所致小鼠抑郁症的影响

倪博然，林龙飞，张慧，倪健

北京中医药大学，北京 100029

目的 评价不同工艺制备的白金胶囊治疗慢性不可预知应激所致小鼠抑郁症的药效。方法 采用慢性不可预知应激制备小鼠抑郁模型。实验小鼠按体质量随机分为模型组、阳性药组、工艺品1（传统工艺）大剂量组、工艺品1小剂量组、工艺品2（精制工艺）大剂量组、工艺品2小剂量组，各药物组小鼠予相应剂量灌胃给药。通过测定小鼠游泳不动时间、悬尾不动时间两个行为学指标考察白金胶囊传统工艺和精制工艺的抗抑郁作用；通过测定小鼠自主活动和体质量考察受试药物是否具有中枢兴奋性或改变动物机体的机能状态的作用。结果 模型组和工艺品2大、小剂量组小鼠游泳不动时间分别为（138.27±40.70）s、（100.01±34.75）s、（88.15±30.62）s，差异有统计学意义（P＜0.01）；模型组和工艺品2小剂量组小鼠自主活动次数分别为（668± 19）次、（705±24）次，差异有统计学意义（P＜0.01）；模型组和工艺品1大剂量组体质量分别为（28.14± 1.25）g、（26.43±2.58）g，差异有统计学意义（P＜0.05）；模型组和工艺品2大剂量组小鼠悬尾不动时间时间分别为（98.29±36.90）s、（87.54±30.05）s，工艺品2大剂量组小鼠悬尾不动时间有缩短趋势，但差异无统计学意义。结论 精制工艺白金胶囊用于治疗慢性不可预知应激所致小鼠抑郁症的药效优于传统工艺。

白金胶囊；传统工艺；精制工艺；慢性不可预知应激；抑郁症；小鼠

抑郁症是一种常见的大脑功能紊乱性疾病，为慢性反复发作的脑疾病，曾被喻为“心理疾病中的感冒”。临床上对抑郁症的治疗模式和方法分类有很多，药物治疗是目前临床上治疗抑郁症的重要手段，但由于抑郁症发病的确切机制仍未完全明确，目前药物治疗仅在一定程度上有效，并不能治愈抑郁症，而且抗抑郁药的安全性问题目前尚无法解决，WHO已将抗抑郁药列为21世纪最需迫切开发的药物之一。白金胶囊药方来自临床经验方，在临床上被用于治疗肝气郁结所致的抑郁症，显示出良好的疗效[1]。但传统工艺制剂携带、服用不便，临床顺应性较差，故将处方中各药味分别精制，将其制成胶囊剂。本研究以ICR小鼠为实验对象，采用慢性不可预知应激制备抑郁模型，以自主活动、体质量、悬尾不动和强迫游泳不动时间为指标，评价白金胶囊传统工艺与精制工艺的抗抑郁药效，为制备工艺变更提供实验依据。

1 实验材料

1.1 动物

雄性ICR小鼠120只，10周龄，体质量18～22 g，北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXK（京）2012-0001。置于室温（23±1）℃，24 h昼夜循环光照条件下饲养，自由饮水取食。

1.2 药物和试剂

郁金（批号20130601）、合欢花（批号20130901）、蜘蛛香（批号20130901），亳州市远光中药饮片厂；白芍（批号201002298），北京同仁堂饮片有限责任公司；姜黄素对照品（批号110823-201004）、槲皮苷对照品（批号111538-200504）、芍药苷对照品（批号110736-201136）、苯甲酸对照品（批号100419-201302），中国食品药品检定研究院；11-ethoxyviburtinal对照品，北京中医药大学高增平教授实验室提供，供含量测定用；白金胶囊工艺品1及2均为固体粉末（本实验室自制）配制成适宜浓度混悬液使用；阳性药物为盐酸氯米帕明片，天津药物研究院药业有限责任公司，批号110703，25 mg/片。乙腈、甲醇均为色谱纯（Fisher公司），蒸馏水。

1.3 仪器

安捷伦1206高效液相色谱仪，Aglient Extend-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），TU-1810紫外可见分光光度仪（北京普析通用仪器有限责任公司），DZ-2BC型真空干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司），METTLER-AE240型电子分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司），KQ3200DE型数控超声波清洗仪（江苏省昆山市超声仪器有限公司），BT125D型电子天平（赛多利斯），小鼠自主活动仪（MV1ZDMACHI.KIKAI.EEO.ZTD，TOKYO），小动物行为分析系统（Ethovision XT 9）。

2 方法与结果

2.1 白金胶囊传统工艺制备方法

按处方比例，将郁金、合欢花、白芍、蜘蛛香以10倍量水提取3次，每次1.5 h，合并提取液，浓缩，蒸干，得白金胶囊传统工艺制品（工艺品1）。采用高效液相色谱法（HPLC），以乙腈-0.1%磷酸溶液（14∶86）为流动相，检测波长为230 nm，流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，进样量10 μL，测定白金胶囊工艺品1中芍药苷的含量为1.96%。

2.2 白金胶囊精制工艺制备方法

对处方中的各药材分别单独提取，继而采用大孔树脂技术进行纯化，并测定各提取物中指标性成分的含量。将纯化后的各药材提取物，按处方比例混匀即得白金胶囊精制工艺制品（工艺品2）。

2.2.1 郁金提取精制工艺优选及姜黄素含量测定 通过正交试验筛选出郁金提取精制工艺为：称取郁金，加入6倍量70%乙醇溶液，回流提取2次，每次1.5 h，滤过，合并提取液，减压浓缩至0.5 g原药材/mL，过S-8型大孔吸附树脂柱，上样量为0.6 g原药材/mL树脂，5 BV水洗弃去，减压回收80%乙醇洗脱液，浓缩干燥，备用。按照2010年版《中华人民共和国药典》（一部）姜黄项下含量测定方法[2]，测定提取精制样品中姜黄素的含量为3.63%。

2.2.2 合欢花提取精制工艺优选及槲皮苷和总黄酮含量测定 正交试验筛选合欢花提取精制工艺为：称取合欢花，加入12倍量70%乙醇溶液，回流提取2次，每次2 h，滤过，合并滤液，减压浓缩至0.2 g原药材/mL，过AB-8型大孔吸附树脂柱，上样量为0.4 g原药材/mL树脂，径高比为1∶8，4 BV水洗弃去，4 BV 10%乙醇洗弃去，减压回收50%乙醇洗脱液，浓缩干燥，备用[3-4]。采用HPLC，以乙腈-0.1%磷酸溶液（20∶80）为流动相，检测波长为256 nm，流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，进样量10 μL，测定提取精制的样品中槲皮苷含量为16.59%。采用AlCl3直接显色法，以槲皮苷为对照品，检测波长为425 nm，测定提取精制样品中总黄酮的含量为30.62%。

2.2.3 白芍提取精制工艺优选及白芍总苷和芍药苷含量测定 正交试验筛选白芍提取精制工艺为：称取白芍，加入14倍量70%乙醇溶液，回流提取3次，每次1.5 h，滤过，合并提取液，减压浓缩至0.2 g原药材/mL，过AB-8型大孔吸附树脂柱，上样量为0.75 g原药材/mL树脂，径高比为1∶8，5 BV水洗弃去，减压回收50%乙醇洗脱液，浓缩干燥，备用。采用HPLC，以乙腈-0.1%磷酸溶液（14∶86）为流动相，检测波长为230 nm，流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，进样量10 μL，测定提取精制样品中芍药苷的含量为36.38%。采用NaOH水解法水解，采用HPLC，以甲醇-0.05 mol/L磷酸氢二钾-异丙醇-冰乙酸（87∶13∶4∶4）为流动相，检测波长为230 nm，流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，测定提取精制样品中苯甲酸的含量，根据公式白芍总苷含量（%）＝苯甲酸含量%×480.27÷ 122.12，计算提取精制样品中白芍总苷的含量为53.11%。

2.2.4 蜘蛛香提取精制工艺优选及11-ethoxyviburtinal含量测定 正交试验筛选蜘蛛香提取精制工艺为：称取蜘蛛香，加入12倍量70%乙醇溶液，回流提取2次，每次2 h，滤过，合并提取液，减压浓缩至0.2 g原药材/mL，过AB-8型大孔吸附树脂柱，上样量为0.52 g原药材/mL树脂，径高比为1∶6，2 BV 30%乙醇洗弃去，减压回收70%乙醇洗脱液，浓缩干燥，备用。采用HPLC，以乙腈-水（40∶60）为流动相，检测波长为288 nm，流速0.95 mL/min，柱温30 ℃，进样量10 μL，测定提取精制样品中11-ethoxyviburtinal的含量为0.92%。

2.3 分组

雄性ICR小鼠适应性饲养3 d，按体质量随机分为模型组、阳性药组、工艺品1大剂量组（4.12 g/kg）、工艺品1小剂量组（1.37 g/kg）、工艺品2大剂量组（2.15 g/kg）、工艺品2小剂量组（0.72 g/kg）。除模型组小鼠为13只外，其余各组小鼠均为15只。

2.4 造模

采用慢性不可预知应激制备小鼠抑郁模型。应激小鼠每日随机接受2种不同的刺激并在造模过程中保持孤养状态，共21 d。实验中采取的刺激方法包括：束缚2 h，45°倾斜饲养笼12 h，昼夜颠倒，禁水12 h，禁食12 h，夹尾刺激1 min，潮湿垫料12 h （每200 g垫料加100 mL水），摇晃鼠笼5 min。

2.5 给药

将临床等效剂量作为各工艺品的小剂量组（含原药材7.38 g/kg），将小剂量组的3倍量作为各工艺品大剂量组（含原药材22.14 g/kg）。分别精密称取上述2种白金胶囊工艺品粉末适量，置研钵中，精密加入蒸馏水研磨均匀，制成浓度分别为0.068 5、0.206 0 g/mL工艺品1混悬液，0.036 0、0.107 5 g/mL工艺品2混悬液。取盐酸氯米帕明片3片，精密加入蒸馏水75 mL于研钵中研磨，超声分散20 min，制成含原药材浓度为1 mg/mL的混悬液，4 ℃保存。各药物组小鼠按相应剂量灌胃，给药体积为0.2 mL/10 g，每日1次，模型组小鼠灌胃等量蒸馏水。各组均在上午9:00－10:00灌胃给药，连续7 d。

2.6 统计学方法

2.7 观察指标及测定结果

2.7.1 不同工艺白金胶囊对小鼠强迫游泳不动时间的影响 于最后1次给药后1 h，将小鼠单个放于高24 cm、直径12 cm烧杯中，水深10 cm，温度（21± 2）℃，每2只小鼠间用挡板隔开动物视线，防止相互干扰，初放入杯内时，小鼠拼命游泳并试图爬上烧杯壁，一段时间后，因失望而活动减弱，表现为身体微曲，鼻孔露出水面，呈漂浮状态，用Ethovision XT 9软件记录小鼠6 min内后4 min的累计不动时间（不动指标为动物除呼吸外，所有肢体均不动）。全程录像拍摄。

小鼠在挣扎一段时间之后便进入一种不动的状态，说明动物处于绝望状态，不动时间缩短体现药物的抗抑郁作用。在观测的4 min内，与模型组比较，阳性药组、工艺品1各剂量组小鼠游泳不动时间均未出现明显差异，但工艺品2各剂量组游泳不动时间均都明显缩短（P＜0.01），且小剂量组较大剂量组缩短更加明显。结果见表1。

2.7.2 不同工艺白金胶囊对小鼠自主活动时间和体质量的影响 于最后1次给药后1 h，用小鼠自主活动仪测定小鼠5 min内的自主活动次数，并称重。与模型组比较，工艺品2小剂量组小鼠自主活动次数多于模型组（P＜0.01），其余各剂量组小鼠自主活动未见明显差异，见表2。小鼠体质量随饲养时间延长逐渐增长，实验结束后与模型组比较，工艺品1大剂量组低于模型组（P＜0.05），见表3。

表1 各组小鼠强迫游泳不动时间比较（±s）

表1 各组小鼠强迫游泳不动时间比较（±s）

注：与模型组比较，**P＜0.01

组别 只数 游泳不动时间/s模型组 13 138.27±40.70阳性药组 15 135.58±43.73工艺品1大剂量组 15 156.31±30.75工艺品1小剂量组 15 144.59±53.50工艺品2大剂量组 15 100.01±34.75**工艺品2小剂量组 15 88.15±30.62**

注：与模型组比较，**P＜0.01

表3 各组小鼠体质量比较（±s）

表3 各组小鼠体质量比较（±s）

注：与模型组比较，*P＜0.05

组别 只数 体质量/g模型组 13 28.14±1.25阳性药组 15 27.15±1.87工艺品1大剂量组 15 26.43±2.58*工艺品1小剂量组 15 27.27±1.26工艺品2大剂量组 15 28.10±2.60工艺品2小剂量组 15 27.95±2.28

2.7.3 不同工艺白金胶囊对小鼠悬尾不动时间的影响 于最后1次给药后1 h，用胶带在距离小鼠尾尖20 mm处将之固定于铁架台上，用Ethovision XT 9软件记录小鼠挣扎和不动状态共6 min，通过软件累计后4 min的不动时间，全程录像拍摄。小鼠在挣扎一段时间后便进入一种不动的状态，说明小鼠处于绝望状态，不动时间缩短体现药物的抗抑郁作用。在观测的4 min内，与模型组比较，各药物组小鼠悬尾不动时间未见明显差异，但是工艺品2大剂量组小鼠悬尾不动时间有缩短趋势。结果见表4。

表4 各组小鼠悬尾不动时间比较（±s）

表4 各组小鼠悬尾不动时间比较（±s）

组别 只数 悬尾不动时间/s模型组 13 98.29±36.90阳性药组 15 71.91±38.06工艺品1大剂量组 15 93.87±45.26工艺品1小剂量组 15 95.01±41.48工艺品2大剂量组 15 87.54±30.05工艺品2小剂量组 15 101.54±39.20

3 讨论

中医学中虽无“抑郁症”病名，但对其认识有着悠久的历史，其应属中医“郁症”“脏燥”“百合病”等范畴，在治疗上也有许多相关记载。有研究表明，中医药治疗抑郁症疗效稳定、作用持久、不良反应少、复发率低、身心整体调治、适合长期服用[5]。

在行为绝望动物模型实验中，药物对动物行为所产生的影响，不仅说明药物具有抗抑郁作用，有可能药物具有中枢兴奋性或改变动物的机体状态。所以，检测小鼠自主活动及其体质量，主要用来检验实验药物是否具有中枢兴奋性或改变动物机体状态的作用。

本实验采用慢性不可预知应激成功制备抑郁小鼠模型。实验结果显示，白金胶精制工艺对小鼠的悬尾不动时间有缩短的趋势，且各剂量组均能明显缩短小鼠游泳不动时间（P＜0.01），且小剂量组较大剂量组更加明显；同时，工艺品2小剂量组小鼠自主活动次数也高于模型组、工艺品2大剂量组。结果表明，精制工艺白金胶囊用于治疗慢性不可预知应激所致的小鼠抑郁症药效优于传统工艺。

[1] 杨培,李雪春,林龙飞,等.基于代谢组学技术的白金胶囊治疗抑郁症的研究[J].世界中医药,2014,10(9)：1341-1345.

[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[M].北京：中国医药科技出版社,2010：247-248.

[3] 张慧,林龙飞,杨培,等.合欢花总黄酮的分离纯化工艺[J].中国实验方剂学杂志,2013,19(18)：27-29.

[4] 张慧,张晋,齐娟娟,等.正交试验法优化白金胶囊中合欢花的提取工艺[J].中国中医药信息杂志,2014,21(3)：78-80.

[5] 蒋美琼,苗明三.中医药治疗抑郁症特点分析[J].中医学报,2013, 28(12)：1881-1883.

Effects of Different Processes of Baijin Capsule on Treatment of Mice with Chronic Unpredictable Stress-induced Depression

NI Bo-ran, LIN Long-fei, ZHANG Hui, NI Jian (Beijing

University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China)

Objective To evaluate the efficacy of different processes of Baijin Capsule to treatment of mice with chronic unpredictable stress-induced depression. Methods Chronic unpredictable stress was used to establish depression mice models. Experimental mice were divided into the following groups according to body mass: model group, positive medicine group, artware one (traditional process) high-dose and low-dose groups, and artware (refining process) two high-dose and low-dose groups. All medication groups were given relevant medicine for gavage. By detecting the two behavior indexes, immobility time of swimming and tail suspension of mice, the anti-depression effects of traditional process and refining process of Baijin Capsule were investigated. By detecting autonomic activities and body mass, tested medicine was examined for function state of central excitation and changing animal body. Results The times for automatic activities of Baijin Capsule in the model and artware (refining process) two high-dose and low-dose groups were (138.27±40.70)s, (100.01±34.75)s and (88.15±30.62)s, respectively, with statistical significance (P<0.01); the mice swimming immobility times in the model and artware (refining process) two low-dose groups were 668±19 and 705±24, respectively, with statistical significance (P<0.01); the mice tail suspension immobility times in model and artware (traditional process) one high-dose groups group were (28.14±1.25)g and (26.43±2.58)g, respectively, with statistical significance (P<0.05); the mice tail suspension immobility times in model and artware (refining process) two high-dose groups were (98.29±36.90)s and (87.54±30.05)s. Mice tail suspension immobility time in artware (refining process) two high-dose group decreased,without statistical significance. Conclusion Refining process of Baijin Capsule can effectively be used to treat mice with chronic unpredictable stress-induced depression, and the efficacy is superior to the traditional process.

Baijin Capsule; traditional process; refining process; chronic unpredictable stress; depression; mice

10.3969/j.issn.1005-5304.2016.01.015

R285.5

A

1005-5304(2016)01-0065-04

2015-03-29)

(

2015-04-21；编辑：华强)

倪健,E-mail：njtcm@263.net