母猪子宫内膜炎致病菌的分离鉴定及药敏试验

2016-12-19孙龙曹玉美伍少钦农秀艳岑玲韦婧婷肖有恩陈泽祥

养猪 2016年1期

关键词：氧氟沙星葡萄球菌断奶

孙龙，曹玉美，伍少钦，农秀艳，岑玲，韦婧婷，肖有恩，陈泽祥

（1.广西农垦永新畜牧集团有限公司良圻原种猪场，广西南宁530317；2.广西壮族自治区兽医研究所细菌研究室，广西南宁530001）

母猪子宫内膜炎致病菌的分离鉴定及药敏试验

孙龙1，曹玉美1，伍少钦1，农秀艳1，岑玲1，韦婧婷1，肖有恩1，陈泽祥2

（1.广西农垦永新畜牧集团有限公司良圻原种猪场，广西南宁530317；2.广西壮族自治区兽医研究所细菌研究室，广西南宁530001）

为探究母猪子宫内膜炎的致病菌及其耐药情况，无菌采集40份子宫内膜炎母猪子宫内容物进行细菌培养及分离鉴定，共分离到细菌47株，分离率为100%。经过鉴定，分离菌主要为大肠杆菌、葡萄球菌、铜绿假单胞菌等细菌。对分离到的细菌进行了药敏试验。结果表明，氧氟沙星、头孢噻肟是敏感性较高的2种抗生素。通过临床试验证实，根据药敏试验结果更改子宫保健方案后能够提高母猪的断奶配种率。

母猪；子宫内膜炎；细菌分离；药敏试验

母猪子宫内膜炎是由一系列致病微生物侵入母猪子宫黏膜表层或深层，引起子宫黏膜的黏液性或脓性炎症过程，是母猪繁殖障碍最主要的细菌性疾病之一。本病在猪场生产中十分常见。发生子宫内膜炎的母猪发情不正常，或发情正常但屡配不孕而被迫淘汰，使母猪的非生产天数增加，减少年产胎次，直接影响母猪的繁殖力，导致养猪成本增高，经济效益下降，由此可见，子宫内膜炎控制不理想会对猪场的生产力带来较大损失。本研究通过对子宫内膜炎母猪无菌采集子宫内容物进行细菌分离鉴定，了解引发母猪子宫内膜炎的主要致病菌种类，通过药敏试验了解致病菌的药物敏感性，为母猪子宫内膜炎的预防和治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验时间与地点

试验于2015年5—7月在广西农垦永新畜牧集团良圻原种猪场进行。

1.2 试验材料

血琼脂平板、伊红美蓝（EMB）培养基、麦康凯培养基、M-H培养基、胆硫乳（DHL）培养基、SC增菌培养基、胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSB）均购自北京陆桥生物试剂公司，16s rRNA引物购自Life公司，药敏纸片购自杭州滨和微生物试剂有限公司。

1.3 样品采集

患病猪外阴部位用0.3%新洁而灭溶液清洗消毒后，用灭菌输精管按人工授精的方法送入子宫腔，注入灭菌生理盐水20 mL，并立即回抽，待回液10mL左右，用封口膜封住输精瓶口，低温避光保存后立即送往实验室4℃保存。

1.4 细菌的分离纯化

混匀样品，无菌操作抽取样品200 μL加入预先准备好的营养肉汤、SC增菌液、TSB肉汤培养基中，37℃温箱中增菌培养24 h，然后在血琼脂平板、麦康凯平板、TSA平板进行分离培养纯化，并通过伊红美蓝培养基及DHL培养基进行初步鉴定。

1.5 菌落观察

对平板上生长的菌落大小、形状、颜色、质地、光泽进行观察并记录。挑取单个菌落进行革兰氏染色，并通过显微镜油镜观察。

1.6 引物的设计与合成

利用16s rRNA两端的保守序列及参考文献报道，设计引物27F/1492R序列，由Life公司合成，扩增目的片段长度为1.5 kb左右。获得目的条带后送广州Invitrogen公司测序。

1.7 药敏试验

对分离纯化后的细菌进行药物敏感试验。所选药物有头孢噻肟、头孢拉定、庆大霉素、氧氟沙星、左旋氧氟沙星、新霉素、卡那霉素、大观霉素、强力霉素、阿奇霉素、恩诺沙星、链霉素、环丙沙星、阿莫西林、青霉素、诺氟沙星、氨苄西林、复方磺胺嘧啶等18种常用药物。药敏效果判定：抑菌圈直径≥20 mm为高敏，抑菌圈直径在15～20 mm为中敏，抑菌圈直径＜15 mm为低敏或不敏感。

1.8 动物临床试验

对实验室筛选的几种抗生素在不同母猪场进行临床试验，分为混饲给药和注射给药两种途径，统计试验猪的断奶配种率，从临床上验证高敏抗生素在体内的抑菌杀菌效果，从而探索出最佳的临床子宫护理保健方案。

2 试验结果

2.1 病原菌的分离检测结果

从不同母猪场共40份子宫内容物样品中共分离到细菌47株，通过培养基鉴别和16s rRNA测序结果，最终测得主要为大肠杆菌、葡萄球菌、铜绿假单胞菌、变形杆菌、沙门氏菌等5种细菌，并以大肠杆菌、葡萄球菌为主，分别占所有检出菌株比例的59.6%、23.4%。铜绿假单胞菌、变形杆菌和沙门氏菌占比相对较低。具体分布见表1。

表140 份母猪子宫内膜炎细菌学检查结果

2.2 药敏试验结果

将分离到的主要致病菌28株大肠杆菌和11株葡萄球菌应用纸片法进行药敏试验以筛选敏感药物，结果如表2所示。分离的28株大肠杆菌中，对头孢噻肟、大观霉素、氧氟沙星、左旋氧氟沙星、头孢拉定、阿奇霉素具有较高的敏感性，高度敏感菌株比例均能达到50%以上，而对常规使用的子宫保健药物青霉素、链霉素均出现耐药性。

分离到的11株葡萄球菌对头孢噻肟、头孢拉定、氧氟沙星、左旋氧氟沙星高度敏感比例最大，对喹诺酮类抗生素较为敏感。而对氨基糖苷类抗生素基本都产生耐药，对常规使用较为频繁的青霉素也出现了耐药性。

表2 大肠杆菌和葡萄球菌的药敏试验

2.3 临床试验结果

实验室分离细菌并进行药敏试验，筛选出两种敏感的抗生素，在两个2 000头规模的母猪场内进行试验。A场试验主要验证林可霉素+大观霉素对子宫炎病菌的抑制作用，B场试验主要验证氧氟沙星对子宫炎病菌的抑制作用，产后8 d进行断奶配种率的统计分析。具体试验分组及结果见表3和表4。

表3 A场两种产后保健方案的对比结果

表4 B场3种保健方案对比结果

A场试验数据表明，试验组（林可霉素+大观霉素组）较对照组（纽弗罗+金霉素组）具有更高的断奶配种率，试验组和对照组断奶配种率分别为89.1%、86.8%；但采食量试验组（林可霉素+大观霉素组）不及对照组（纽弗罗+金霉素组），说明林可霉素+大观霉素在口感方面没有纽弗罗+金霉素好，影响了母猪的采食量。

B场试验数据表明，氧氟沙星组比阿莫西林组及青霉素+链霉素组具有更高的断奶配种率，且对子宫流脓的控制情况也优于阿莫西林组和青霉素+链霉素组两组。采食量方面没有较大影响，说明氧氟沙星组可以较好地控制子宫内膜炎的发生，提高断奶配种率，减少母猪的非生产天数。

3 讨论

子宫内膜炎是影响母猪断奶再次发情的主要疾病，主要由几种病原体的混合感染引起，是临床中降低猪场非生产天数和增加母猪淘汰率的主要因素，不同地区甚至不同的畜牧公司病原菌的种类差异较大。本次试验从本公司4个母猪场中出现子宫内膜炎母猪的40份病料中分离到细菌47株，主要病原菌是大肠杆菌、葡萄球菌、铜绿假单胞菌、变形杆菌、沙门氏菌，检出率分别为70.0%、27.5%、10.0%、5.0%和5.0%。大肠杆菌和变形杆菌是条件性致病菌，在猪抵抗力降低或环境较差时，细菌会进入子宫并大量繁殖，可单独或与其他细菌配合引起母猪子宫内膜炎的发生。葡萄球菌是常见的革兰氏阳性菌，往往会引起急性炎症或化脓性感染。本次试验分离到较多的大肠杆菌和葡萄球菌，与文献报道的基本一致，而子宫感染分离率较高的链球菌在本次试验中没有分离到。

药敏试验是对分离到的致病菌在分离培养后进行的药物敏感性试验，能够指导临床用药。本次试验还对检出率较高的大肠杆菌和葡萄球菌进行了药敏试验，结果显示，本公司猪场使用率较低的头孢类抗生素对大肠杆菌和葡萄球菌具有较高的敏感性，大观霉素对大肠杆菌具有较高的抑制作用，而对革兰氏阳性菌葡萄球菌的作用较弱。猪场实际应用过程中，大观霉素虽能提高断奶配种率，却遇到采食量稍有下降的问题，可能是生产工艺不好、口感欠佳造成的。氧氟沙星属喹诺酮类药物，抗菌谱广，抗菌活性高，对分离到的大肠杆菌和葡萄球菌都具有较强的抑制作用。根据药物代谢动力学/药物效力动力学理论，喹诺酮类药物属于浓度依赖性药物，是抗菌活性在很大范围内随药物浓度的增大而增加的一类药物，跟作用时间关系不大，因此相对高剂量的给药能够获得较好的效果。临床使用氧氟沙星对产后母猪进行连续3 d的肌肉注射能够明显提高母猪的断奶配种率。但由于氧氟沙星不是兽用专用药，在食用动物上的广泛使用可能会造成细菌的耐药，造成在人身上用时效果减退，因此2015年6月9日农业部发布公告自2016年1月1日起停止经营、使用洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星等4种原料药的各种盐、脂及其各种制剂。以后子宫炎细菌分离及药敏试验要避免使用此4类抗生素进行试验。

在我国当前的养殖条件下，母猪子宫内膜炎的情况依然严重，是影响母猪的产后发情率的主要因素。环境中常在的条件性致病菌是母猪子宫内膜炎主要感染菌，其中大肠杆菌是本病的主要感染菌。良好的猪舍环境和彻底的空栏消毒是控制本病的最佳解决方案。依靠药物治疗只能起到缓解的作用，很难对患病动物进行根除。同时，在使用药物进行产后保健时还应遵循交叉用药和轮换用药的原则，不能长时间的依靠某一种抗生素，这样才会尽量减少细菌耐药性的产生。

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（致谢：本试验得到广西壮族自治区兽医研究所细菌研究室陈泽祥研究员团队的大力支持，特此表示衷心感谢。）

（编辑：富春妮）

不吃肉会导致营养缺乏

【法国《费加罗报》10月27日报道】题：不摄入动物蛋白，难以避免营养缺乏

法国雷恩农学院人类营养实验室负责人菲利普·勒格朗接受本报记者采访，主要内容如下：

《费加罗报》问：为什么肉类摄入问题在我们的膳食平衡中非常敏感？