猪链球菌与猪繁殖与呼吸综合征病毒混合感染的诊断研究

王红宝，郭雪丽，李红丽，吉涛，杨晋青，王志俊，韩惠瑛，段亚娜，郑明学，古少鹏

（1.山西省农业科学院畜牧兽医研究所，山西太原030032；2.山西省动物疫病预防控制中心，太原030027；3.山西农业大学，晋中030801）

猪链球菌与猪繁殖与呼吸综合征病毒混合感染的诊断研究

王红宝1，郭雪丽1，李红丽1，吉涛1，杨晋青1，王志俊1，韩惠瑛2，段亚娜1，郑明学3，古少鹏3

（1.山西省农业科学院畜牧兽医研究所，山西太原030032；2.山西省动物疫病预防控制中心，太原030027；3.山西农业大学，晋中030801）

通过细菌学检查、ELISA试剂盒检测、阳性猪场RT-PCR检测、病理剖检和病理组织学观察，对部分地区流行的以繁殖障碍、高热、呼吸异常、耳朵发绀、皮肤发红等症状的病猪或病死猪病因进行了探讨，初步认为这次疾病的流行是由猪链球菌与猪繁殖与呼吸综合征混合感染造成的，混合感染加重了此次疫情所造成的损失。

猪链球菌；猪繁殖与呼吸综合征；混合感染；诊断；研究

猪链球菌病（Streptococcus suis,SS）是由多种致病性猪链球菌感染引起的一种常见的猪传染病，早在20世纪50年代，在英国和荷兰就有人报道了猪群中有链球菌病的发生，1998年在江苏、2005年在四川资阳及周边地区发生猪链球菌病，导致几十万余头猪死亡，并引起人感染发病甚至死亡，给人类的健康带来了巨大威胁[1-4]。该病一年四季均可发生，5～11月份较多见，在猪群中常见散发或呈地方性流行[5-6]。在养猪生产实践中，猪链球菌病常常被养猪生产者所忽视，而导致“高热病”发病猪场大批猪发病死亡的直接性致病病因，大多是由于猪链球菌的感染，给猪场带来重大损失。近十多年来很多猪场不明病因的种猪繁殖障碍现象，也被证明与猪链球菌感染有关[7-8]。猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）是由病毒引起的一种接触性传染病，又名猪蓝耳病。1987年首次在美国发现[9]，1996年郭宝清等在我国首次分离到蓝耳病病毒（PRRSV）[10-11]，近几年该病在我国部分省市已广为流行。该病各种年龄的猪均可发病，但病情、症状差异较大，主要特征是母猪呈现发热、流产、木乃伊胎、死产、弱仔等症状；仔猪表现异常呼吸症状和高死亡率[12-14]。猪繁殖与呼吸综合征病毒感染对猪链球菌病具有“引爆”和“放大”效应，给很多猪场猪的疾病防控带来很大困扰。

笔者自2011年以来，对山西吕梁、临汾、晋城等部分地区规模化猪场流行的一种以繁殖障碍、高热、呼吸异常、耳朵发绀、皮肤发红等症状的病猪或病死猪，经流行病学调查、临床症状、病理解剖及实验室检测，确诊为猪链球菌混合感染猪繁殖与呼吸综合征。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 血样的采集与处理

采集不同发病地区发病急、传染快、死亡率高；眼睑水肿，眼结膜潮红，流泪，鼻镜干燥；繁殖障碍、高热、呼吸异常、耳朵发绀、皮肤发红等症状的病猪的血清。肥育猪及仔猪前腔静脉采血（母猪耳静脉采血），每份血样3～5 mL，于离心管中静置30 min，待血清析出后，干冰冷藏送至实验室，3 000 r/min离心10 min，分离血清，-20℃保存备用。

1.2 试验方法

1.2.1 细菌学检查

（1）取心血涂片，进行革兰氏染色，显微镜检查。

（2）取心血分别接种鲜血琼脂平板，营养琼脂平板，麦康凯平板。37℃需氧培养24 h后，挑取可疑菌落接种于改良马丁肉汤，37℃培养24 h后，革兰氏染色，镜检。

（3）随机抽取细菌血清肉汤培养物，分别做糖发酵试验、乙酰甲基甲醇试验（Voges-Prokauer reaction，V-P）、甲基红（Methyl Red，M.R）试验、硫化氢产生试验、枸橼酸盐利用试验、吲哚（靛基质）试验等生化试验。

（4）将细菌按5×108～10×108CFU细菌/鼠的剂量腹腔接种4只20 g/只左右的小白鼠，观察48 h。

1.2.2 酶联免疫吸附测定（Enzyme linked immunos orbent assay,ELISA）试剂盒检测分别应用猪繁殖与呼吸综合征和链球菌病ELISA试剂盒检测抗体。ELISA检测方法分别按其试剂盒要求方法进行操作。

将试剂盒中试剂恢复至室温（18～25℃），轻轻旋转或振荡混合。1）取出抗原包被板，在记录表上记录样本的位置；2）在包被孔内加入100 μL未稀释的阴性对照，每次设定2个阴性对照孔；3）在包被孔内加入100 μL未稀释的阳性对照，每次设定2个阳性对照孔；4）在相应的孔中加入100 μL 40倍稀释血清样本；5）18～25℃孵育30 min；6）吸弃各孔的液体，然后加300 μL洗涤液，自动洗板洗涤4次；7）每孔加入100 μL辣根过氧化酶标记的抗猪IgG抗体；8）18～28℃孵育30 min；9）重复步骤6；10）每孔加入100 μL TMP底物液；11）18～25℃孵育15 min；12）每孔加入100 μL终止液，终止反应；13）置酶标仪650 nm处测量并记录各孔吸光值A；14）统计并分析结果。

1.2.3 猪繁殖与呼吸综合征阳性猪场RT-PCR检测

用TaKaRa RNAiso Reagent提取血清中的总RNA，用PrimeScriptTM One Step RT-PCR Kit Ver.2对所提取的RNA进行RT-PCR扩增。具体反应程序为：42℃45 min，95℃3 min，1个循环；94℃30 s，55℃30 s，72℃30 s，35个循环；72℃延伸10 min。

1.3 病理学研究

追踪调查流行情况以及临床症状。无菌取病猪、病死仔猪及母猪和流产胎儿、新生发病和病死仔猪的鼻甲骨黏膜、心、肝、脾、肾和肺脏等组织于10%福尔马林液中固定，石蜡包埋，切片，H.E染色，镜检。

1.4 试剂

PRRSV Antibo dy Test Kit和Streptococcus Suis Antibo dy Test Kit均购自IDEXX公司；RNAiso Reagent和PrimeScriptTM One Step RT-PCR Kit Ver.2购自TaKaRa生物工程有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

2 结果

2.1 细菌学检查结果

（1）取心血涂片，进行革兰氏染色，镜检，可见单个或成对的革兰氏阳性球菌。

（2）取心血分别接种鲜血琼脂平板、麦康凯平板、营养琼脂平板、改良马丁肉汤等，培养后，革兰氏染色，显微镜检查，结果发现：血液琼脂中形成光滑、边缘整齐、半透明小菌落，周围呈β溶血；在麦康凯琼脂平板上不生长。在营养琼脂上生长不好。该菌在改良马丁肉汤中底部有沉淀，在血清肉汤中先均匀浑浊，后在试管底部形成沉淀，上部澄清，不形成菌膜。

（3）在葡萄糖、乳糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、阿拉伯糖、木糖、甘露醇、山梨醇、卫矛醇等培养基中均为阳性，在水杨苷、菊糖、棉子糖、侧金盏花醇等培养基中呈阴性。乙酰甲基甲醇试验（V-P）、甲基红（M.R）试验、硫化氢产生试验、枸橼酸盐利用试验、吲哚（靛基质）试验等试验为阴性，均符合猪链球菌的生化特性，说明分离的菌均为猪链球菌。

（4）4只接种病料的小白鼠，48 h内全部死亡。剖检发现小鼠脾脏肿大，并从死亡小鼠的心血、脾脏分离到革兰氏阳性的链球菌，确诊为致病性链球菌。

2.2 血清学调查

2.2.1 猪链球菌和猪繁殖与呼吸综合征抗体检测结果猪链球菌和猪繁殖与呼吸综合征抗体检测结果见表1。

表1 来自不同地区病猪血清的猪链球菌和猪繁殖与呼吸综合征抗体检测结果

2.2.2 抗PRRSV抗体变化趋势PRRSV持续性感染猪群的PRRS抗体动态曲线见图1。图中纵坐标为S/P值，PRRS抗体的阳性/阴性通过计算样品与阳性对照（S/P）的比值进行判定。S/P值低于0.4样品判定为PRRS抗体阴性，S/P值大于或等于0.4样品判定为PRRS抗体阳性。从图中可以看出整个群体抗PRRSV抗体均为阳性，S/P值均在1.0以上，第9周抗体水平上升至2.0以上。

图1 PRRSV持续性感染猪群的PRRS抗体动态曲线

2.3 猪繁殖与呼吸综合征阳性猪场RT-PCR结果

根据检测结果表明，检测出的阳性片段分别为410 bp和500 bp，见图2。经基因测序结果发现检测出的阳性片段为PRRSV的Nsp2基因片段，其中410 bp为PRRSV变异株，500 bp为PRSSV普通株，普通株仅占30%，其他均为变异株。猪群血清阳性检出率为51.26%。

图2 猪繁殖与呼吸综合征阳性猪场PRRSV RT-PCR结果

2.4 病理学检查结果

2.4.1 临床症状病猪主要表现为高热（41℃左右），而且高热持续不退，皮肤出现红斑等症状。繁殖母猪反复表现出呼吸加速，食欲不振。有的患病母猪耳朵、腹部、乳头、外阴、尾部和腿发绀，耳朵发绀的患病猪多出现在耳尖部分。患病的怀孕猪在怀孕晚期发生早产、流产、弱仔、死胎或木乃伊胎；仔猪1月龄内最易感染，表现的症状较明显，死亡率高。大多数新生仔猪患病后表现呼吸困难（腹式呼吸），后肢麻痹，肌肉震颤等症状。肥育猪或种公猪发病率较低，仅为5%左右，发病后表现为咳嗽、呼吸急促、发热等症状，有的病猪表现出皮肤出血，耳朵、背部或体表发紫。

2.4.2 尸体剖检及病理组织学观察病猪及病死猪剖解后可见肺出血、水肿，心外膜和心内膜点状出血；脾出血，有的出现灰白色坏死灶；肾脏及膀胱黏膜有点状出血。淋巴结肿胀，呈大理石样外观；死胎全身发紫，脐带出血、扩张。

病理组织学观察发现病猪或病死猪主要表现为弥漫性间质性肺炎，肺泡壁、小叶间显著增宽，有大量淋巴细胞和巨噬细胞浸润、水肿。肾脏主要表现皮质部肾小球毛细血管丛呈严重充血和出血，毛细血管内皮肿胀或增生，毛细血管腔内经常见有均质红染的透明血栓。肾小管间间质血管也表现充血或出血，间质增生，血管周围见有淋巴细胞浸润。

3 小结与讨论

（1）根据追踪调查，本次流行的以繁殖障碍、高热、呼吸异常、耳朵发绀、皮肤发红等症状的病猪或病死猪，最早发生于2011年5月份某地区的个别养猪场，7月份面积逐渐扩大，到9月份后流行趋缓、发病减少，10月份仍有个别发生。8～9月份是此次以繁殖障碍、高热、呼吸异常、耳朵发绀、皮肤发红等症状的猪病流行的高峰期。分析认为发病的主要原因是因为猪场从外场调入生猪时带来病原所致，从而造成本次疾病的流行。本次疾病传播迅速，各种年龄的猪都有发病，发病率高，仔猪死亡率高；发病时间较长，从半个月到3个月；怀孕母猪发病后流产、产死胎严重；病猪临床特征是出现“无名高热”，病程后期临床症状表现复杂。

（2）猪链球菌病一般不单独发病，常常与其它疾病并发或互为继发感染。本次流行的临床以“无名高热型”为主的疾病传播迅速、死亡率也比较高，给养殖户造成了严重的损失，主要是猪链球菌病与猪繁殖与呼吸综合征混合感染所致，其表现症状在临床实践中往往会被误认为主要是猪繁殖与呼吸综合征或主要是猪链球菌病的感染。猪繁殖与呼吸综合征病毒感染对猪链球菌病具有“引爆”和“放大”效应，给很多猪场猪的疾病防控带来很大困扰。

（3）从不同地区部分“高热征”病死猪机体中检测到的病原还有大肠杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌等。

（4）猪繁殖与呼吸综合征病毒持续性感染情况非常复杂，因为在感染阶段抗体水平较高，但中和抗体是否与病毒发生相互作用并不十分清楚，用当前的PCR和ELISA检测手段很难如实反映其感染的真实情况[15]。

（5）研究发现[16-17]，PRRSV的抗体具有依赖性增强作用，抗PRRS抗体可以通过Fc受体增强PRRSV感染，猪群在隐性感染阶段抗体水平普遍较高，比较容易检出病毒，其发生机制有待进一步研究。

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（编辑：郭玉翠）

低脂饮食并非最佳减肥方式

【英国《每日邮报》网站10月30日报道】题：低脂饮食无效：在表示没有证据表明减少脂肪摄入有助减肥后，科学家对流传多年的健康建议提出质疑

今天一项大型研究称，低脂饮食并非最佳减肥方式，从而对流传数十年的健康建议提出质疑。

科学家们表示，没有证据支持人们应该减少饮食中的脂肪量这一教条。

这一研究对英国国民保健制度（NHS）32年前给出的指导意见提出了问题—NHS警告民众避免摄入黄油、全脂牛奶和其他高脂食物。

哈佛大学的研究人员说，卫生部门官员应该提出主要关注每份食物重量及未加工食物的简单指导意见，而不是关注于脂肪、碳水化合物和蛋白质。

研究带头人戴尔德丽·托拜厄斯博士说：“没有确凿证据表明，应该建议人们采用低脂饮食。”这一研究基于超过6.8万名成年人的数据。

托拜厄斯说：“尽管人们普遍接受的教条是，要减轻体重就需要减少脂肪摄入量，但并没有科学证据证明，就长期减肥而言，低脂饮食优于其他饮食干预措施。”

1983年，英国政府发布指导意见，建议英国人将脂肪摄入量减至总能量的30%，并增加碳水化合物的摄入。

批评人士说，这导致“特种”食品大量增加，使人们痴迷于卡路里计算，并催生出庞大的减肥产业。新出现的证据表明，并非所有种类的脂肪都是有害的，其中一些脂肪能够在保护心脏和减轻体重方面扮演重要角色。

现在人们对地中海饮食的兴趣越来越强，而地中海饮食中既包括水果、蔬菜和全谷类，也包括橄榄油、鱼和坚果等众多高脂食物。

哈佛大学的这一研究团队发现，要减轻体重，减少脂肪摄入量不如低碳水化合物饮食或地中海饮食有效。

研究人员整理了此前53项比较低脂饮食有效性的试验的资料，并把研究结果发表在《柳叶刀·糖尿病和内分泌学杂志》上。

研究显示，在12个月期间，与低脂饮食人士相比，低碳水化合物饮食人士平均多减重1.15千克。

研究人员发现，只有与“惯常饮食”（即不改变饮食习惯）的人士相比，低脂饮食者减重较多，平均多减了5.41千克。

（转自参考消息[N]，2015-11-02）

Study on Diagnosis of Mixed Infection of Streptococcus Suis and Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus

WANG Hongbao1,GUO Xueli1,LI Hongli1,JI Tao1,YANG Jinqing1,WANG Zhijun1,HAN Huiying2, DUAN Yana1,ZHENG Mingxue3,GU Shaopeng3
(1.Institute of Animal Husbandry and Veterinary,Shanxi Academy of Agricultural Sciences,Taiyuan 030032, China;2.Animal Disease Prevention and Control Center in Shanxi Province,Taiyuan 030027,China; 3.Shanxi Agricultural University,Jinzhong 030801,China)

By bacteriology examination,ELISA,RT-PCR detection in positive pig,pathological autopsy,pathological and histological observation.The symptom and causes such as reproductive disorder,high fever,abnormal breathing,cyanosis ears,skin redness of disease of pigs or dead pigs causes of popular in some areas were discussed in this paper.The preliminary conclusion is that an epidemic of this disease is by streptococcus suis and porcine reproductive and respiratory syndrome caused by mixed infection,mixed infection increased the losses caused by the disease.

streptococcus suis;porcine reproductive and respiratory syndrome virus;mixed infection;diagnosis; study

S858.28

A

1002-1957(2016)01-0113-04

2015-12-08

山西省农业科学院科技攻关项目（2012ygg35）

王红宝（1968-），男，山西翼城人，副研究员，主要从事动物疾病诊断和防治研究.E-mail：sxnkywhb@163.com

郭雪丽，副研究员.E-mail：sxnkygxl1969@163.com