一例严重猪乙型脑炎与伪狂犬病混合感染的诊断

2016-12-19赵军朱玲徐志文

养猪 2016年1期

关键词：清液乙型狂犬病

赵军，朱玲，徐志文

（四川农业大学动物医学院动物生物技术中心，四川成都611130）

一例严重猪乙型脑炎与伪狂犬病混合感染的诊断

赵军，朱玲，徐志文

（四川农业大学动物医学院动物生物技术中心，四川成都611130）

2015年7月，四川眉山某猪场发生15日龄左右仔猪大面积死亡，临床症状表现为高热、抽搐、呼吸急促、精神沉郁、不采食等，病程短，发病1 d后死亡，呈现典型病毒病症状。发病率达80%，死亡率达100%。剖检病死猪发现全身淋巴结出血，肺瘀血、水肿，打开颅腔后发现脑和脊髓膜充血出血，通过流行病学和实验室诊断确诊为伪狂犬病和流行性乙型脑炎混合感染。

猪乙型脑炎；猪伪狂犬病；混合感染；诊断

流行性乙型脑炎是由黄疸病毒科乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus,JEV）引起的蚊媒性严重危害人畜健康的急性传染病，主要通过蚊叮咬吸血传播。临床表现为高热、狂暴或沉郁、意识障碍、抽搐、呼吸衰竭及脑膜刺激等神经症状，具有明显的季节性和一定的地理分布区域，多发生于虫蚊较多的夏秋季节，属于自然疫源性疾病[1-2]。猪在乙型脑炎的传播中起着很重要的作用，被认为是其扩大传播的主要容器[3]。乙型脑炎能引起母猪繁殖障碍，怀孕母猪流产、产死胎或木乃伊胎，公猪急性睾丸炎，严重时丧失配种能力[4]。

猪伪狂犬病（Pseudorabies,PR）是由猪伪狂犬病病毒（Pseudorabiesvirus,PRV）引起的一种以发热、脑脊髓炎为主要症状的急性高度接触性传播疾病，新生仔猪出现神经症状，发病率和死亡率可达100%[5]；成年猪感染后表现为一过性发热，打喷嚏，多可耐过，呈隐性感染，但造成长期带毒、排毒，成为传染源，严重危害养猪业[6]。

1 材料与方法

1.1 试验时间与地点

试验于2015年7—8月在四川农业大学动物生物技术中心进行。

1.2 病料采集

本次通过临床诊断和剖解病理变化的观察，对疾病初步判定为乙脑和伪狂犬病，针对该两种疾病无菌采集相关病变较严重的器官、组织。分别采集两头病死猪脑、扁桃体、淋巴结、肺脏、脾脏、肝脏，分别编号为1号、2号；同时采集其鼻腔分泌液，分别编号1号、2号，带回实验室进行病原诊断[7]。

1.3 菌种及主要试剂

大肠杆菌DH5α由四川农业大学动物生物技术中心保存。PMD19-Tsimple载体购自宝生物工程（大连）有限公司；TaqDNA聚合酶购自宝生物工程（大连）有限公司；DNA Marker DL 2 000、DNA纯化回收试剂盒、质粒小量抽提试剂盒等购自北京天根生化科技有限公司。

1.4 引物合成

引用文献[8]乙脑病毒引物序列，根据GenBank中收录的伪狂犬病病毒（PRV）全基因序列经DNAStar进行同源性分析，用Primer 5.0设计引物，在用NCBI在线BLSAT对引物的特异性进行验证，设计上、下游引物，分别是PRV-E1：5'-ACCTGAGCGTCC TGCGG-3'，PRV-E2：5'-CCGTTGTGGGTCATCACGA G-3'，扩增产物长度为544 bp；PRV-GE1：5'-CGGG ATCCATGCGGCCCTTTCTGCTGC-3'，PRV-GE2：5'-CGGAATTCTTAAGCGGGGCGGGACATCA-3'，扩增产物大小为1 754 bp；JEV-P1：5'-GCTCTTATCACGT TCTTCAAGTTTAC-3'，JEV-P2：5'-TTCCCAGACAAT TAAAACTGTAAGC-3'，扩增产物长度为754 bp。引物由成都擎科梓熙生物技术有限公司合成。

1.5 病毒总RNA的抽提及PCR扩增

组织样品分别放入匀浆器里，编号后加1 mL Trizol裂解液进行匀浆，匀浆充分后室温静置5 min，12 000 r/min，离心5 min；取上清液，加入200 μL氯仿迅速振荡，室温静置5 min，12 000 r/min，离心15 min；向最后获得的上清液中加入等量异丙醇沉淀RNA，轻轻摇晃混匀，室温作用10 min后，12 000 r/min离心15 min，弃上清液，加1 mL 700 mL/L冰乙醇，12 000 r/min离心5 min，轻轻弃去无水乙醇，自然风干，溶解于40 μL无Rnase水中，-20℃保存备用。按照宝生物工程（大连）有限公司RT-PCR试剂盒说明书合成cDNA，将反转录产物于-20℃保存备用。以P1、P2为检测引物PCR反应程序为：95℃5 min，95℃30 s，55℃30 s，72℃30 s，30个循环；72℃终延伸10 min。以本实验室建立的猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测方法分别进行相关病原的检测。反应体系为ddH2O 3 μL，2×Taq PCR Master Mix 5 μL，上下游引物各0.5 μL，模板1 μL，PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.6 病毒总DNA的抽提及PCR扩增

组织样品放入匀浆器，匀浆充分后室温静置5 min，12 000 r/min，离心5 min；取上清液500 μL，加入500 μL饱和酚迅速振荡，室温静置5 min，12 000 r/min，离心5 min；取上清液，向获得的上清液中加入200 μL氯仿、饱和酚摇匀静置5 min，轻轻摇晃混匀，12 000 r/min离心5 min；取上清液，向上清液中加400 μL的氯仿摇匀静置5 min，12 000 r/min离心5 min；取上清液，加2倍体积的异丙醇轻轻摇匀，放入-20℃冻20 min，12 000 r/min离心5 min；取上清液，加1 mL 700 mL/L冰乙醇，12 000 r/min离心5 min，轻轻弃去无水乙醇，自然风干，溶解于40 μL ddH2O中，-20℃保存备用。以E1、E2为检测引物PCR反应程序为：95℃5 min，95℃30 s，60℃30 s，72℃30 s，30个循环；72℃终延伸10 min。反应体系为ddH2O 2 μL La Taq DNA聚合酶0.1 μL dNTP Mixture 1 μL，2×GC Buffer II 5 μL，上下游引物各0.5 μL模板1 μL，PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.7 JEV PrM/c基因和PRV-gE全基因的克隆与序列测定

用胶回收试剂盒纯化PCR产物，按照PMD19-Tsimple载体试剂盒说明书连接后将筛选的阳性重组质粒送宝生物工程（大连）有限公司测序。

使用DNAStar软件[6]对克隆获得的PRV gE全基因序列进行拼接。从NCBI的GenBank中下载部分世界毒株序列作为参考与试验获得的序列比较。同时用Basic Local Alignment Search Tool（BLAST）（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）对序列的同源性进行确认。多重序列的对齐由ClustalW完成。采用MEGA6.0中的近邻结合法（Neighbor-Joining）构建系统进化树用于PCV2全基因的分子遗传进化分析。所有分析都是在使用Kimura-2参数模型下对JEV PrM/c基因（721 bp）和PRV-gE全基因序列（1 737 bp）而进行的。

2 结果

2.1 临床症状

发病哺乳仔猪体温41.3～41.7℃，患猪浑身无力，颤抖，抽搐，站立不稳，精神沉郁，昏睡，呕吐奶汁，呼吸急促、精神沉郁、不采食、排黄色水状稀粪。眼睑水肿，眼球外突，四肢呈游泳状划动，死亡时发出尖叫，牙关紧咬，角弓反张。

2.2 剖检病变

剖检2头发病刚死亡哺乳仔猪，主要病变表现为肝脏呈土黄色；肾脏表面有大量针尖状的红色出血点，质地变脆；肺脏有散在的出血斑，轻微水肿；心脏冠状脂肪上有针尖状的出血点；脑膜充血明显、脑脊液增多；扁桃体肿大、充血、喉头黏膜充血、水肿。

2.3 病原学检测结果

结合临床症状和流行病学调查，实验室检测时针对病原做了相关检测。乙脑病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒做了RT-PCR检测，伪狂犬病病毒做了PCR检测。检测结果见表1，凝胶电泳如图1。

表1 乙脑病毒和伪狂犬病病毒检测

图1 电泳检测结果

2.4 序列分析

对JEV PrM/c基因（721 bp）和PRV-gE全基因序列（1 737 bp）进行序列同源性分析，结果显示，发病猪场感染的乙脑病毒属于基因Ⅲ型，序列同源性为99%；眉山（ms）分离到的猪伪狂犬病gE全基因与参考株之间的相似性为98.3%～98.7%（图2），表明眉山株gE基因的变异明显。从图3进化树分析结果显示，眉山株与福建分离株（福建株登录号为FJ176390.1）距离最近。

图2 眉山株与选取的参考株之间的遗传距离

图3 眉山株与参考株建立的遗传进化树

3 讨论

猪伪狂犬病病毒和猪乙型脑炎病毒是导致猪繁殖障碍的两种主要病原，并且两种病毒均为多宿主病原。乙型脑炎作为人兽共患病受到很大的重视并积极预防；除了猪以外其他宿主感染伪狂犬病病毒后死亡率为100%。当前针对伪狂犬病虽然有基因缺失疫苗[9]，针对乙型脑炎有弱毒疫苗[10]，但是在养猪生产中这两种疾病却常有发生。本次案例发生时间为2015年7月，正值酷暑蚊虫肆虐季节，为乙型脑炎的传播提供了条件。

从临床症状分析不难得出，两种病原一起发病势必会对仔猪造成快速的病理损伤。在剖检病理观察时，病变部位几乎遍布大部分器官组织，并且多为急性出血、充血。总结分析以往多例伪狂犬病发病临床症状，此次伪狂犬病极有可能存在很大的抗原表位漂移导致其组织嗜性发生变化，从而导致猪发病后所表现的临床症状发生改变。

基因序列分析表明，本次获得的乙型脑炎病毒基因序列在基因分型上属于基因Ⅲ型，并未测毒力基因，所以不再做过多分析。本次获得的伪狂犬病病毒gE基因序列从遗传距离图谱可以得出，其与从NCBI收录的PRV gE序列的同源性在98.3%～98.7%之间，与福建分离株的同源性最高，从遗传进化树分析可以得出眉山株的变异情况明显。

当前，规模化猪场虽然在疾病的防控和治疗上都相对规范，但是各种病毒病和细菌病却时有发生，多维多病原混合感染，加之猪只免疫力低下，因此，临床上治疗疾病的难度很大。猪场要贯彻“养重于防，防重于治，预防为主，养防结合”的方针，认真落实各项生物安全措施，防止病原侵入猪场。针对猪病要做到早发现、早诊断、早用药、早治疗；用药对路、方法科学、方案可行，药量足，疗程够的方针。坚持消毒制度，猪舍周围要填平洼地，铲除杂草，清理杂物，杀灭各种吸血昆虫及鼠等，并用2%火碱水溶液进行消毒。养猪场要少用或不用抗生素，尤其是不要滥用或长期使用劣质的抗生素，因为这些药物不仅对机体具有免疫抑制作用，影响疫苗的免疫效果，而且易产生耐药性与药物残留，影响预防与治疗疫病的效果，威胁公共卫生的安全。搞好免疫预防，提高猪群的特异性免疫力，制定合理的免疫程序，不要盲目接种疫苗，只有科学有效地管理猪场的日常生产生活才能使效益最大化。

[1]赵以云，王强，左瑞华.猪乙型脑炎的诊断与科学防治[J].畜牧与饲料科学，2009（Z1）：8-11.

[2]胡仲达.猪乙型脑炎病的诊断与防制[J].现代农业科技，2010（1）：329-330.

[3]曹俊卫.浅谈猪乙型脑炎的防治措施[J].农民致富之友，2014（6）：233-234.

[4]高群，冯琦璞，王宇.猪乙型脑炎诊断技术[J].北京农业，2011（12）：92-93.

[5]陈叶，付新亮，粟硕，等.猪伪狂犬的防控策略和净化[J].广东饲料，2014（6）：46-48.

[6]景广宇.猪伪狂犬的诊断方法及防治措施[J].畜禽业，2014（11）：78-80.

[7]朱秀高.猪场病原检验方法的应用分析与建议[J].广东畜牧兽医科技，2013（2）：14-17.

[8]袁磊.四川地区乙型脑炎病毒的分子流行病学调查研究[D].雅安：四川农业大学，2012.

[9]刘涛，赵京媛，孙晓成.猪伪狂犬疫苗研究进展[J].兽医导刊，2012（12）：72-74.

[10]巢伟，张桂红，徐雷.猪乙型脑炎病毒SA14-14-2疫苗株基础种子的鉴定[J].中国兽药杂志，2014（7）：15-18.

（编辑：富春妮）

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