猪GPR40基因的多态性及其对肉质性状的影响

董莲花，李杰，蒋明，陈斌

（1.湖南农业大学动物科学技术学院，湖南长沙410128；2.畜禽遗传改良湖南省重点实验室，长沙410128）

猪GPR40基因的多态性及其对肉质性状的影响

董莲花1，2，李杰1，2，蒋明1，2，陈斌1，2

（1.湖南农业大学动物科学技术学院，湖南长沙410128；2.畜禽遗传改良湖南省重点实验室，长沙410128）

试验以杜洛克猪、大白猪、大围子猪、沙子岭猪、桃源黑猪、五指山猪和杜长大商品猪为试验材料，通过测序和PCR-RFLP的方法对G蛋白偶联受体40基因（GPR40）的多态性进行检测，并分析该基因对猪肉质性状的影响。结果表明，在GPR40基因外显子606位点存在A-G突变，该位点除了大围子猪和杜洛克猪外，其余5个猪种均处于Hardy-Weinberg平衡状态；在肉质性状上，GPR40基因606A-G位点贮存损失AA型和GG型差异不显著，而AG型显著低于AA型和GG型；肉色等级与肉质色度，AA型和AG型差异不显著，但都显著高于GG型。推测GPR40基因可能是一个影响猪肉色的分子遗传标记。

GPR40；限制性内切酶；多态性；肉质性状

我国是养猪大国，同时也是猪肉消费大国，猪肉在我国的日常饮食中有着举足轻重的地位。随着社会的发展、人们生活水平的提高及口味选择的变化，人们对猪肉品质的要求越来越高，育种工作者的育种重点也由降低猪背膘厚、提高瘦肉率等向提高猪肉风味、口感及营养等方面发生转变[1]。研究表明，肉质的风味、多汁性和嫩度与肌内脂肪含量直接相关[2]，因此一些与脂肪代谢平衡及脂肪沉积相关的基因也成为肉质分子选育的重要候选基因。

G蛋白偶联受体（G-protein couple receptors, GPCRs），又称为7α螺旋跨膜受体蛋白，是体内最大的蛋白质超家族。GPCRs蛋白的肽链包括7个跨膜α螺旋、1个N末端、1个C末端、3个胞外环和3～4个胞内环，GPCRs能与胞内的G蛋白结合并激活细胞内信号通路[3]。G蛋白偶联受体40（G protein-coupled receptor 40,GPR40）是发现较晚的一种G蛋白偶联受体，它可被中、长链脂肪酸所激活，故又被称为游离脂肪酸受体1（Free fat acid receptor 1,FFAR1）[4]。作为游离脂肪酸（Free fatty acid,FFAs）的受体，GPR40在脂肪代谢平衡中具有重要作用。此外，研究显示，长链脂肪酸（long chain fatty acids,LCFAs）在细胞中和GPR40结合后，利用胞外途径来放大葡萄糖的刺激从而分泌胰岛素而阻断GPR40表达，能减弱FFAs的刺激，最终使胰岛素分泌降低[5]。本试验以杜洛克、大白猪、沙子岭猪、五指山猪、大围子猪、桃源黑猪和杜长大商品猪为研究对象，采用PCR-RFLP方法对GPR40基因进行多态性分析，并将其与肉质性状进行关联性分析，旨在挖掘与肉质性状相关联的遗传分析标记，为生猪育种工作提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验时间与地点

试验于2013—2014年在湖南农业大学动物科学技术学院进行。

1.2 试验材料

试验猪耳样采自于正虹原种猪场、益阳农科所种猪场和地方品种猪种猪场。其中正虹原种猪场大白猪71头、杜长大65头；益阳农科所种猪场杜洛克47头、大白猪62头；地方猪品种五指山猪47头、大围子猪45头、桃源黑猪48头、沙子岭猪15头。剪取试验猪小块耳组织放入灭菌的1.5 mL Eppendorf管中，加入70%的酒精，放于-20℃用于提取DNA。随机选取平均体重达到100 kg左右时的72头大白猪进行屠宰测定。

1.3 基因组DNA提取与检测

苯酚/氯仿法提取基因组DNA后，TE溶解，采用Nanodrop 2000核酸测定仪检测DNA浓度及纯度，-20℃保持备用。

1.4 性状测定

对屠宰的试验猪测定其嫩度、肉色、pH、滴水损失、失水率、熟肉率、大理石纹等指标，指标测定在屠宰现场和畜禽遗传改良湖南省重点实验室进行。其中肉色采取传统评分和色差仪两种方法测量，色差仪测量肉质色度。

1.5 引物设计及PCR扩增

根据GenBank上公布的猪GPR40基因mRNA序列（XM_003127043.1），利用NCBI和BLAST程序在线比对获得猪GPR40外显子序列，利用Primer 5.0和Oligo 6.0软件设计引物，引物由上海生工有限公司合成，引物信息见表1。

表1 GPR40基因引物

PCR扩增条件：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，68℃复性30 s，72℃延伸60 s，33个循环；72℃延伸10 min，4℃保存。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.6 SNP位点检测

分别选取杜洛克猪、大白猪、大围子猪、沙子岭猪、桃源黑猪、五指山猪和杜长大商品猪各10个DNA混池，以DNA混池为模板进行PCR反应，结果用琼脂糖凝胶电泳检测，选取特异性高、条带明亮单一的PCR产物进行检测，测序反应由铂尚生物技术（上海）有限公司完成。

测序结果用DNAStar7.1软件比对寻找SNP位点，然后继续通过DNAStar7.1软件分析确定限制性内切酶的酶切位点。

1.7 扩增产物的酶切

1.7.1 限制性内切酶的选择使用DNAStar7.1软件对包括SNP位点在内的4～7个碱基选择内切酶，尽量保证除SNP位点外，DNA片段的其他片段区域内无该内切酶酶切位点，如存在多个酶切位点，必须保证不用基因型DNA酶切后片段大小能通过电泳区分开来，以便区分基因型。利用DNAStar7.1软件选出的内切酶见表2。

表2 GPR40基因的限制性内切酶

1.7.2 酶切反应体系和反应条件GPR40 606A-G位点TaiⅠ酶切反应体系：酶切反应总体系为15 μL，10×Buffer Tango缓冲液1.5 μL，TaiⅠ（10 U/μL）0.15 μL，PCR产物5 μL，其余的用超纯水补齐，65℃水浴4～6 h。酶切反应后的PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.8 统计分析

应用Excel 2010软件分别计算基因型频率、等位基因频率，并进行卡方检验，判断多态位点是否偏离Hardy-Weinberg平衡，且根据GPR40各位点在所选猪种中的分布情况，计算所选猪群样本的遗传杂合度（He）、多态信息含量（PIC）和有效等位基因数（Ne）。统计屠宰测定猪的基因型，再结合肉质测定结果，用SAS9.2软件进行方差分析，估计不同基因型的最小二乘均值。分析所采用的模型（GLM）如下：Yijkn=μ+hi+lj+gk+εijkn，其中Yijkn为肉质性状表型值，μ为总体均值，hi为猪场效应，lj为时间效应，gk为GPR40基因基因型对肉质性状的效应，εijkn是随机误差的效应，服从正态分布（0，σ2）。

2 结果

2.1 突变位点分析

用DNAStar 7.1软件比对GPR40基因的测序结果发现，GPR40基因外显子606位点存在A→G突变。经分析，该突变引起了编码的氨基酸的变化，使编码的氨基酸由异亮氨酸Ile（AUA）突变成蛋氨酸Met（AUG），具体情况见图1。

图1 GPR40基因突变位点测序

2.2 GPR40基因外显子区606A-G多态位点检测结果

经TaiⅠ酶切后会产生204 bp、483 bp 2个大小的片段。酶切产物经过电泳后得到3种带型，其中GG型含有204 bp和483 bp 2种条带，AG型含有204 bp、483 bp和687 bp 3种条带，AA型只有687 bp 1种条带。电泳检测结果见图2。

图2 GPR40基因外显子区TaiⅠ-RFLP酶切电泳结果

2.3 GPR40基因多态位点在不同猪种中的分布

由表3可知，GPR40基因606 A-G位点除沙子岭猪不存在多态性，杜洛克猪、大白猪、大围子猪、桃源黑猪、五指山猪和杜长大商品猪都存在遗传多态性，大围子猪未检测到AA型。从基因频率可以看出，在外来猪种中，A等位基因为优势等位基因。等位基因A的频率大白猪最高（0.834 6），其次是杜洛克（0.627 7）和杜长大商品猪（0.561 5），大围子猪最低（沙子岭猪除外）。在地方猪种中除五指山猪外等位基因G的频率均高于等位基因A，桃源黑猪的等位基因G频率最高达到0.927 1。通过对各品种试验猪的基因型分布适合性χ2检验后发现，大白猪、五指山猪、桃源黑猪、沙子岭猪和杜长大商品猪都处于Hardy-Weinberg平衡状态，说明在该位点这几个品种（组合）处于随机交配的稳定状态。而地方品种大围子猪和外来品种杜洛克猪不处于Hardy-Weinberg平衡状态。

表3 GPR40 606A-G位点基因型频率和基因频率

由表4可知，GPR40基因606A-G位点各猪种（组合）的遗传纯合度都高于0.5，其中沙子岭猪处于完全纯合状态，外来猪种中大白猪的纯合度较高（0.720 6），地方猪种中桃源黑猪的遗传纯合度最高（0.864 8）。从有效等位基因数上看，GPR40基因606A-G位点有效等位基因数变化趋势为五指山猪>杜长大>大围子猪>杜洛克>大白猪>桃源黑猪>沙子岭猪，和试验群体的遗传杂合度和多态信息含量变化一致。在多态信息含量上，五指山猪、大围子猪、杜洛克、杜长大均处于0.25～0.5之间，该4个品种在此位点具有遗传多态性，且具有较大的遗传变异。其他3个品种的多态信息含量都低于0.25，为低度多态性，其中沙子岭猪不具有多态性。

表4 GPR40 606A-G位点遗传多态性分析

2.4 GPR40基因多态位点对猪肉质性状的影响

由表5可知，GPR40基因606A-G位点对贮存损失、肉色等级和肉质色度3个性状的影响达到了显著性水平，而对其他性状未发现显著性影响。在贮存损失性状上，AA型和GG型无显著差异（P> 0.05），AG型与AA型和GG型差异均显著（P< 0.05），AG型比AA型和GG型分别低29.54%和33.17%。在肉色等级性状和肉质色度性状上基因型差异一致，均为AA型和AG型差异不显著，而GG型与AA型和AG型均差异显著；GG型个体的肉色等级比AA型和AG型个体分别低8.59%和7.53%，GG型个体在肉质色度性状上比AA型和AG型分别低35.43%和34.57%。

表5 GPR40 606A-G位点对猪肉质性状的影响

3 讨论

3.1 GPR40基因遗传结构分析

G蛋白偶联受体（GPR40）也称游离脂肪酸受体1（FFAR1），是中、长链游离脂肪酸的内源性受体，它介导了游离脂肪酸对葡萄糖刺激的胰岛素分泌双时相效应[6]。研究显示，GPR40基因与2型糖尿病及肥胖有重大关联[7-8]。

本试验检测了杜洛克猪、大白猪、大围子猪、沙子岭猪、桃源黑猪、五指山猪和杜长大商品猪GPR40基因TaiⅠ酶切位点的基因（型）频率，并对基因型在不同品种（组合）中的分布进行了Hardy-Weinberg平衡检验，发现在该多态性位点上杜洛克猪和大围子猪不处于Hardy-Weinberg平衡状态，其原因可能为两品种猪试验样本数不够，或为该品种猪长期选育的结果，其他5个品种均符合Hardy-Weinberg平衡，说明样本具有代表性。

检测发现，外来品种杜洛克和大白猪中，处于优势地位的是A等位基因，而杜长大中等位基因A和等位基因G相差不大（A为0.561 5、G为0.438 5），这可能跟未检测的长白猪的基因频率分布有关。地方品种中，桃源黑猪和沙子岭猪等位基因G占绝对优势，其中桃源黑猪中G等位基因达到0.927 1，而沙子岭猪在检测的样本中更是达到100%的G等位基因，是否沙子岭猪均为G等位基因还有待加大样本量进一步检测验证；五指山猪和大围子猪两种等位基因基因频率相差不大。从基因型频率分布情况来看，AA型和AG型在杜洛克猪、大白猪和杜长大杂交猪种3个品种中的分布占优势；而在地方品种中，AG型和GG型占优势，并且在沙子岭猪和大围子猪中还没检测到AA型的存在，可能与这两个品种的样本数量太少有关。从多态性分布情况看，杜洛克猪、五指山猪、大围子猪和杜长大商品猪的遗传杂合度较高，而大白猪、桃源黑猪和沙子岭猪遗传杂合度较低，这与猪品种（组合）的种质特性有关，加上不同的纯种猪群，各品种（组合）选择强度也不同，综合起来造成了不同品种遗传多态性的差异。

3.2 GPR40基因与猪肉质性状的相关分析

本试验以GPR40基因作为猪肉质性状的候选基因，研究该基因一个多态位点与猪肉质性状的关系。但是，因为屠宰条件的限制，本试验只分析了72头大白猪GPR40基因的多态位点不同基因型与猪肉质性状的关联。检测结果发现，GPR40基因606AG位点贮存损失AA型与GG型差异不显著，但AG型显著低于AA型与GG型；肉色等级和肉质色度，AA型和AG型显著高于GG型，且AA型与AG型差异不显著。由此可以看出，GPR40基因606A-G位点等位基因A可能是影响猪肉色等级和肉质色度的一个有利基因，表明GPR40基因可以作为猪肉质性状的候选基因。猪群与遗传学背景不同常常会导致一个基因位点的遗传变异对肉质性状的遗传效应不同，选择样本也存在各种各样的差异，最后这些原因均会影响统计分析结果，关于GPR40基因多态性对肉质性状的效应仍需要扩大样本量进行研究。

4 结论

本研究以GPR40基因做为猪肉质性状的候选基因，通过混池测序再结合PCR-RFLP方法检测对7个猪品种（组合）TaiⅠ酶切位点的基因频率和基因型频率进行检测，并与肉质性状数据进行了关联分析。结果发现，GPR40基因外显子存在606A-G突变；关联分析表明，GPR40基因多态性对猪肉质性状具有一定的遗传效应，可能是影响肉色的一个分子遗传标记。

[1]李德臻.猪脂肪诱导转录基因FIT的分子生物学基础研究[D].武汉：华中农业大学，2010.

[2]Schwartzkopf-Genswein K S,Faucitano L,Dadgar S,et al.Road transport of cattle,swine and poultry in North America and its impact on animal welfare,carcass and meat quality：A review[J].Meat science,2012,92(3)：227-243.

[3]Katritch V,Cherezov V,Stevens R C.Structure-function of the G-protein-coupled receptor superfamily[J].Annual review of pharmacology and toxicology,2013,53：531.

[4]武珅，陆涛峰，武爽，等.G蛋白偶联受体40研究进展[J].遗传，2013，35（1）：27-34.

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[6]张莹.G蛋白偶联受体40介导游离脂肪酸对胰岛β细胞脂毒性作用的研究及机制初探[D].广州：中山大学，2007.

[7]Del Guerra S,Bugliani M,D'Aleo V,et al.G-protein-coupled receptor 40(GPR40)expression and its regulation in human pancreatic islets：the role of type 2 diabetes and fatty acids[J].Nutrition,Metabolism and Cardiovascular Diseases,2010,20(1)：22-25.

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（编辑：富春妮）

不吃主食减肥更年期提前

不吃主食减肥，是当下流行的一种减肥方法。“不吃主食”可能在短期内奏效，因为身体吸收少，体重会下降。但这种方法的最大弊端是：除非坚持一辈子，否则一旦恢复吃主食，体重就会一直反弹。

一些人在坚持不吃主食一段时间后，会出现皮肤变差、脱发的情况，有人抱怨自己呼气时有股烂苹果味儿，还有人感觉记忆力下降，甚至出现脾气古怪、情绪烦躁、难以沟通的迹象。这些负面作用让人有种提前进入更年期的感觉。实际上，没有不好的食物，只有不合理的膳食，关键在于平衡。主食不仅要吃，还要注意粗细搭配。

（摘自《北京青年》）

The Polymorphism of GPR40 Gene and Its Effects on Meat Quality Traits in Pig

DONG Lianhua1,2,LI Jie1,2,JIANG Ming1,2,CHEN Bin1,2
(1.College of Animal Science&Technology,Hu'nan Agricultural University,Changsha 410128,China; 2.Hu'nan Provincial Key Laboratory for Genetic Improvement of Domestic Animal,Changsha 410128,China)

In this experiment,the Duroc,Yorkshire,Daweizi,Shaziling,Taoyuan,Wuzhishan and the DLY Hybrid were chosen,the polymorphism of G protein-coupled receptor 40(GPR40)detected through the sequencing and PCR-RFLP method,and we also analyzed the association of polymorphisms of GPR40 with the meat traits,the results show that the extron of GPR40 gene has 606A-G mutations,and 606A-G are in Hardy Weinberg equilibrium besides Daweizi and Duroc pigs;on the meat quality traits,storage losses of AA and GG genotype difference was not significant,but the AG significantly lower than AA type with GG type;flesh-colored levels and fleshy chromaticity same,AA and AG were no significant differences,but both higher than the GG genotype.GPR40 gene is likely to be one of the molecular genetic markers for flesh-colored levels.

GPR40;restriction enzyme;polymorphism;lipid metabolism;meat traits

S828.8

A

1002-1957(2016)01-0061-04

2016-01-05

国家现代农业产业技术体系建设专项资金（CARS-36）

董莲花（1991-），女，湖南衡阳人，在读硕士研究生，研究方向为动物遗传育种与繁殖.E-mail：donglianhua013＠126.com

陈斌，教授，博士生导师，博士.E-mail：chenbin7586＠126.com