RP-HPLC法同时测定石榴皮和石榴汁中鞣花酸的含量

2016-12-19范高福付恩桃刘修树

安徽科技学院学报 2016年5期

关键词：花酸石榴皮石榴

范高福，付恩桃，汤洁，刘修树，王玮

(1.合肥职业技术学院生物应用技术系，安徽合肥 238000；2.合肥市食品药品监督检验所，安徽合肥 238000)

RP-HPLC法同时测定石榴皮和石榴汁中鞣花酸的含量

范高福1，付恩桃1，汤洁1，刘修树1，王玮2

(1.合肥职业技术学院生物应用技术系，安徽合肥 238000；2.合肥市食品药品监督检验所，安徽合肥 238000)

目的：建立同时检测石榴皮、汁中鞣花酸的含量测定方法。方法：采用反相高效液相色谱法，Hypersil C18 (250 mm×4.6 mm，5μm)色谱柱，以乙腈-0.3% TFA(20 ∶80)为流动相，梯度洗脱，流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，检测波长254 nm。结果:鞣花酸0.1048～20.96 μg/mL之间线性关系良好(r=0.9999)，平均加样回收率为99.55%(RSD=1.44%，n=9)。结论:此方法灵敏快速、准确易行，可用于石榴皮、汁中鞣花酸含量的同时检测。

鞣花酸;石榴皮;石榴汁;反相高效液相色谱法;含量测定

石榴(PunicagranatumL.)，别名安石榴，为石榴科石榴属落叶灌木或小乔木，具有药食同源价值，可以离体种植培养[1]，主要分布于安徽怀远、山东枣庄、陕西临潼、四川会理、云南蒙自、新疆叶城等地区。石榴皮和石榴汁分别为石榴的干燥果皮和新鲜果汁，均含有丰富的多酚类、类黄酮、花色素等生物活性物质[2]，其中多酚类鞣花酸(ellagic acid, EA)成分研究较多，呈多酚二内酯结构特征，是没食子酸的二聚衍生物，具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎及抗菌等多种药理作用[3]。据文献报道以石榴皮提取物测定鞣花酸含量方法较多，而以石榴汁为原料测定少见，未见对安徽地区石榴皮、汁中鞣花酸含量同时测定方法具体报道，本实验采用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)，建立石榴皮、汁提取物中鞣花酸含量同时测定方法，为安徽本地石榴提取物的深加工研究与开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

石榴：安徽怀远(购自蚌埠市石榴水果批发市场，经安徽中医药大学药学院彭华胜教授鉴定为石榴科石榴属石榴)；甲醇、乙腈为色谱纯；鞣花酸对照品：纯度≥95%(美国Sigma，批号：2075083)；Milli-Q超纯水，其他试剂均为分析纯；石榴汁、皮提取物，本实验室自制。

1.2 仪器与设备

Thermo-U3000 UHPLC系统：配有TCC-3000RS紫外检测器及DAD-3000二极管阵列检测器，美国赛默飞公司；Milli-Q Biocel超纯水系统；KQ-2200E型超声波清洗器(昆山舒美超声仪器有限公司)；RE-52AA型旋转蒸发仪(上海楚柏实验室设备有限公司)；FA1004型电子天平(天津天马)，HWS24型电热恒温水浴锅(上海一恒科技有限公司)，SHB-III型循环水式多用真空泵(郑州长城科教仪器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件色谱柱：Hypersil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm) ；流动相：乙腈：0.3%三氟乙酸(Trifluoroacetic acid ，TFA)(20 ∶80)；柱温30 ℃；流速1.0 mL/min；进样量10 μL；检测波长254 nm。在此色谱条件下，鞣花酸特征峰峰型良好，其色谱图如图1所示。

图1 HPLC色谱图

1.3.2 对照品溶液的制备精密称定鞣花酸对照品10.48 mg，置于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，制成浓度为0.1048 mg/mL的对照品储备液[4]。

1.3.3 供试品石榴汁溶液的制备[5]称取新鲜石榴，剥皮去籽榨汁，4000 r/min离心除去悬浮物，用旋转蒸发仪浓缩体积约至原来1/10，取10 g浓缩物，再用酸化甲醇(含盐酸1.2 mol/L和0.2 g维生素C)50 mL超声1 h，溶解后10000 r/min离心5 min后再取上清液，备用。酸化甲醇加入量=W/2*10(W为浓缩物质量)。

1.3.4 供试品石榴皮溶液的制备将石榴皮在30 ℃晾干，用粉碎机打成粉末，精密称取1.005 g，加80%(φ)丙酮100 mL浸渍约6 h，超声(功率500 W，频率40kHz)处理1 h，滤过，残渣用80%(φ)丙酮30 mL洗脱，合并滤液和洗涤液，用旋转蒸发仪浓缩至干燥物，加50%酸化甲醇溶液100 mL(含1. 2 mol /L的盐酸和0. 2 g维生素C)，90 ℃回流，再用旋转蒸发仪浓缩至干燥物，用甲醇溶解，定容100 mL 容量瓶中[6-7]。精密吸取10 mL于50 mL容量瓶中，用甲醇定容，0.45 μm的微孔滤膜滤过，滤液作为供试品溶液。

1.3.5 检测波长的选择对照品溶液采用二极管阵列检测器进行扫描，吸收图谱见图2。结果表明在254 nm处鞣花酸有最大吸收，无干扰峰出现，且分离度较好。最终确定254 nm作为检测波长[8-9]。

图2 鞣花酸对照品溶液二极管阵列扫描图

2 结果与分析

2.1 线性关系考察

精密吸取鞣花酸对照品溶液适量，稀释后得浓度为0.1048、0.524、1.048、2.096、5.240、10.48、20.96 μg/mL的系列标准溶液，照“1.3.1”项下色谱条件注入高效液相色谱仪，记录色谱图，以峰面积为横坐标(X)，系列标准溶液浓度为纵坐标(Y)，绘制鞣花酸的标准曲线，鞣花酸的回归方程为：Y=0.6285X+0.0468，r=0.9999(n=7)，线性范围为0.1048～20.96 μg/mL。

2.2 精密度试验

取浓度为1.048 μg/mL的对照品溶液，连续进样6次，每次进样量为10 μL，得鞣花酸的峰面积的RSD 0.28%，说明仪器精密度良好。

2.3 稳定性试验

取石榴汁样品溶液按上述色谱条件分别在0、1、2、4、6、8、12、24 h进样，进样量为10 μL，计算得鞣花酸的峰面积的RSD 0.41%，说明样品在24 h内稳定。

2.4 重复性试验

取石榴汁样品平行制取供试品溶液6份并分别进样，进样量为10 μL，鞣花酸峰面积的RSD 1.02%，重复性良好。

2.5 加样回收率试验

取已知质量浓度(1.048 μg/mL)的石榴汁10 mL，共9份，按照低、中、高三个浓度分别加入适量鞣花酸对照品溶液，按1.3.3项下方法制备。并进样分析，计算鞣花酸的平均回收率为99.55%(见表1)，RSD 1.44%。

表1 鞣花酸加样回收率(n=9)

2.6 样品含量测定

取安徽怀远产地石榴2种，分别为白石榴(A品种)和红石榴(B品种)，按照“1.3.3和1.3.4”项下制备供试品石榴汁、皮溶液，按外标法测定鞣花酸的含量，结果见表2。

表2 石榴汁、皮中鞣花酸的含量(n=3)

3 结论与讨论

采用RP-HPLC法同时测定安徽石榴皮、汁中鞣花酸含量时，考察了样品提取过程及样品不同部位对提取物含量的影响。通过酸化提取液可加速提取物石榴鞣花酸的浸出，因提取物石榴鞣花酸具有多酚结构，易氧化，加入维生素C可阻碍提取过程中石榴鞣花酸的氧化变质。通过对石榴汁、皮的相同处理方法，结果表明石榴皮部位鞣花酸含量是石榴汁部位约3.5～6倍，白石榴品种鞣花酸含量是红石榴品种约1倍。另外，在乙醇、丙酮、甲醇不同溶剂对石榴皮、汁中石榴鞣花酸提取物溶解度对比，结果发现甲醇中的溶解度较好，且干扰峰较少，可以满足样品制备的需要，因此选择甲醇作为样品制备的溶剂。

预实验结果表明该样品以乙腈-0.2%TFA作为流动相有可能实现预期的色谱峰分离，并在此流动相系统基础上进一步进行比例筛选，最终确定以乙腈-0.3%TFA(20 ∶80)为流动相体系时，样品峰和杂质峰能够实现较好的分离，且分离度大于1.5。此外，考察了流动相的不同pH对峰形的影响，分别选择加入0.1%、0.2%、0.3%及0.4%的TFA的出峰情况，结合峰的分离和峰形，最终选择加入0.3%的TFA作为流动相。

本实验建立了同时测定石榴皮、汁中鞣花酸含量的反相高效液相色谱(RP-HPLC)方法，经方法学考察，该方法符合《中国药典(2015年版)》中有关质量标准建立的要求[10]，具有灵敏快速、准确易行、重现性好等优点，可用于准确测定石榴皮、汁中鞣花酸的含量。

本课题组收集了安徽地区主产地怀远的石榴样品，并对其石榴皮、汁中鞣花酸含量进行了测定，结果表明石榴皮所含鞣花酸含量较石榴汁中明显高，白石榴品种所含鞣花酸含量较红石榴品种高，提示以石榴皮为药材有一定的合理性，并可作为石榴中鞣花酸质量控制提供参考。此外，目前石榴主要作为水果食用，加工主要是取石榴瓤榨汁为主，其石榴皮多作为废物处理，为石榴皮变废为宝，回收再利用提供依据。

[1]彭丽萍，郜海莲．防止软籽石榴外植体褐变的研究[J]．安徽科技学院学报，2011，25(2)：28-31．

[2]李海霞，王钊，刘延泽．石榴科植物化学成分及药理活性研究进展[J]．中草药，2002，33(8)：765-766．

[3]冯立娟，陶吉寒，尹燕雷，等．石榴功能物质鞣花酸研究进展[J]．食品科学，2014，35(23)：325-330．[4]唐婧，郑胜彪，张雪梅，等．超声提取-高效液相色谱测定滁菊中的木犀草素[J]．安徽科技学院学报，2010，24(6)：48-51．

[5]彭海燕，陈祥贵，刘振平，等．RP-HPLC法测定石榴汁中鞣花酸的含量[J]．食品科技，2012，37(4)：283-285．

[6]丁楠，高晓黎．HPLC法测定石榴皮提取物中鞣花酸的含量[J]．新疆医科大学学报，2012，35(6)：770-772．

[7]周本宏，吴振华，刘春，等．高效液相色谱法测定石榴皮中鞣花酸的含量[J]．广东药学院学报，2005，21(6)：693-694．

[8]刘振平，陈祥贵，彭海燕，等．RP-HPLC法同时测定石榴皮中4种多酚类成分的含量[J]．中国药房，2013，24(3)：238-240．

[9]陈孝娟，顾政一，徐芳，等．不同产地的石榴皮总多酚的含量测定[J]．时珍国医国药，2011，22(3)：541-543．

[10]国家药典委员会编.中华人民共和国药典(四部)[S].2015年版,北京:中国医药科技出版社,2015:59-61.

Content Simultaneous Determination of Ellagic Acid in Pomegranate Peel and Juice by RP-HPLC

FAN Gao-fu1, FU En-tao1, TANG Jie1, LIU Xiu-shu1,WANG Wei2

(1.Department of Biotechnology Applications, Hefei Vocational and Technical College, Hefei 238000, China;2. Hefei Institute for Food and Drug Control， Hefei 238000, China)

Objective: To estabish a method for the content determination of ellagic acid in pomegranate peel and juice. Methods: RP-HPLC method was used. The determination was carried out on Hypersil C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)with mobile phase consisted of acetonitrile-0.3%TFA(20 ∶80)with gradient elution at a flow rate of 1.0 mL/min. The column temperature was 30 ℃. The detection wave length of ellagic acid was at 254 nm. Results: The line range was 0.1048～20.96 μg/mL for ellagic acid(r=0.9999). The average recoveries were 99.55%(RSD=1.44%, n=9). Conclusion: The method is sensitive and rapid, accurate and feasible for the content determination of ellagic acid in pomegranate peel and juice.

Ellagic acid;Pomegranate peel; Pomegranate juice; RP-HPLC; Content determination